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基于网络药理学预测二妙丸“一方多效”的分子机制
目的:基于网络药理学思路与方法,研究二妙丸中有效成分、靶点、通路之间的关系,预测其可能的“一方多效”药理机制.方法:依托中药分子机制的生物信息学分析工具服务器(BATMAN-TCM)对二妙丸进行成分-靶点的预测和筛选,借助检索相互作用的基因/蛋白质的搜索工具平台(STRING)构建靶蛋白互作网络,利用BiNGO和MCODE插件对靶基因进行基因本体(G0)生物过程富集和聚类分析,通过注释、可视化和集成发现的数据库(DAVID)平台对关键靶点京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路进行富集分析.结果:二妙丸活性成分作用于血清白蛋白(ALB),丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1),肿瘤坏死因子(TNF),前列腺素内环氧合酶2(PTGS2),5-羟色胺受体2A(HTR2A),腺苷脱氨酶(ADA),糖皮质激素受体(NR3C1)等37个关键靶点;参与炎症反应、神经传导、金属阳离子稳态平衡、氧化还原、脂质代谢、核苷酸代谢等GO生物过程;调控TNF,TRP通道炎症调控,FcεRI信号通路,Ⅱ型糖尿病,钙离子信号通路,5-羟色胺以及多种信号转导、肿瘤、细胞色素P450通路.结论:二妙丸除具有治疗痛风、关节炎、湿疹等炎症疾病外,还可能具有抗糖尿病周围神经病变、治疗神经系统、胃肠系统、心血管系统疾病的“一方多效”作用.
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基于网络药理学的益母草作用机制分析
目的 基于网络药理学方法研究益母草主要活性成分及药理机制,为新药研发提供参考.方法 检索中药系统药理学分析平台(TCMSP)收录的益母草化学成分,以口服生物利用度(OB)≥30％和类药性(DL)≥0.18为标准筛选活性成分,并找出活性成分对应靶点.构建益母草活性成分-靶点网络、靶蛋白互作网络(PPI),运用DAVID平台进行靶点GO功能富集和KEGG信号通路富集.结果 发掘益母草主要活性成分14种,对应靶点216个(包括5个关键靶点AKT1、TP53、IL-6、CALM2、JUN),参与生物过程509个.KEGG关键通路包括催产素信号通路、补体及凝血级联反应、血小板活化、TNF信号通路等.结论 本研究初步揭示了益母草药效物质基础及多维药理作用,可为益母草开发利用提供参考.
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草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用的研究
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是当前引起我国草鱼出血病的主要病原,其外衣壳蛋白通常在病毒的组织嗜性和细胞嗜性上发挥重要作用.本研究利用共定位、Dot-Blot技术和His-Pull Down技术,验证了草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的相互作用.将pDsRed1N1-VP7,pDsRed1N1-VP56分别与pEG-FP-Fibulin-4共转染草鱼性腺细胞GCO.结果显示,病毒蛋白VP7,VP56和草鱼蛋白Fibulin 4均分布于细胞质中,两种蛋白都与Fibulin-4有部分重叠.应用Dot-Blot Overlay技术,将纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF膜上,经过His-VP7,His-VP56蛋白的孵育,结果表明随着杂交的蛋白量从低到高,蛋白信号由弱到强,His-VP7与His-VP56都能够吸附于GST-Fibulin-4蛋白上并发生相互作用,而不能吸附GST蛋白.利用Pull Down技术,裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白,结合His-VP7,His-VP56的HisPur CobaltResin,在Elution中均能检测到GFP-Fibulin-4蛋白质,而检测不到对照蛋白质GFP,进一步证实了VP7,VP56与Fibulin-4蛋白之间的相互作用.
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ClanGV的PIF0与其他经口感染因子间的互作研究
本文旨在通过酵母双杂交技术研究杨扇舟蛾颗粒体病毒(ClanGV)的经口感染因子PIF0和其他经口感染因子PIF1～PIF6之间的互作关系.首先根据ClanGV的基因组序列信息,利用在线软件TMHMMServer v.2.0对PIF0～PIF6进行跨膜区分析,确定需要扩增的片段.然后以诱饵载体pGBKT7和捕获载体pGADT为出发载体,构建了PIF0的重组诱饵载体(B0)和PIF1～PIF6的重组捕获载体(A1～A6).自激活实验证明,重组诱饵载体B0没有自激活特性,可以进一步开展蛋白的互作研究.酵母双杂交结果证明,PIF0作为诱饵载体时,可以与PIF3和PIF5的重组捕获载体发生蛋白相互作用,与PIF1、PIF2、PIF4和PIF6都没有互作现象.本研究结果将有助于揭示PIF0在ClanGV经口感染过程中的功能,并可为阐明ClanGV的经口感染机制以及开发新型病毒杀虫剂和增效剂奠定基础.
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基于系统发育树的乳铁蛋白相互作用蛋白的预测
目的 利用MEGA5.05软件构建乳铁蛋白及与其相互作用蛋白的系统发育树,以进一步寻找与乳铁蛋白相互作用的蛋白质.方法 将乳铁蛋白序列及与其相互作用的蛋白质序列以FASTA格式载入MEGA5.05软件,进化树生成算法采用邻接法,校验次数为1000次,其他参数为缺省数值,生成系统进化树.结果 与乳铁蛋白相互作用的蛋白质和乳铁蛋白之间有一定的同源关系,与乳铁蛋白相互作用的蛋白质之间也有一定的同源关系.结论 通过MEGA5.05软件构建系统发育树,可以预测出乳铁蛋白与肌红蛋白、载脂蛋白D、谷氨酰胺合酶可能存在相互作用.
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豚鼠耳蜗外毛细胞Prestin互作蛋白的识别与分析
目的 识别可与耳蜗外毛细胞Prestin互作的蛋白并分析其生物学功能,为探究Prestin 蛋白的调控及作用机制提供线索.方法 以豚鼠耳蜗为实验对象进行免疫共沉淀联合质谱技术鉴定可与Prestin相互作用的蛋白谱,使用生物信息学方法构建Prestin蛋白互作网络,通过交叉比对一级互作质谱蛋白谱与蛋白互作网络,确定豚鼠耳蜗外毛细胞Prestin的互作蛋白并进行功能注释.结果 免疫共沉淀联合质谱分析结果显示可与Prestin蛋白相互作用的可信蛋白有116种,通过构建Prestin 互作蛋白网络并与质谱结果进行匹配,经亚细胞定位后确定与Prestin具有直接互作关系的蛋白有8种:EEF2、HSP90AB1、FN1、FLNA、EEF1A1、HSP90B1、ATP5A1、ERH,其主要参与Prestin蛋白的合成转运、跨膜折叠与定位、维持蛋白的结构稳定、信号转导等方面.结论 EEF2、HSP90AB1、FN1、FLNA、EEF1A1、HSP90B1、ATP5A1、ERH通过参与Prestin蛋白的合成转运、跨膜折叠与定位、信号转导等生物学过程构建Prestin蛋白在外毛细胞特殊的跨膜结构,为实现耳蜗外毛细胞的感音放大功能提供分子基础.
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计算机模拟研究冠心宁注射液主要成分治疗心血管疾病的网络药理学机制
目的 利用计算机模拟研究冠心宁注射液主要成分治疗心血管疾病的网络药理学机制.方法 以冠心宁注射液中主要药效成分丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸、丹参酮ⅡA、紫草酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、川芎嗪、丁苯酞、藁本内酯为研究对象,利用反向分子对接技术进行靶点预测和筛选,通过蛋白互作网络、GO生物过程富集、KEGG信号通路富集,研究冠心宁注射液治疗心血管疾病的药理机制.结果 冠心宁注射液11个药效成分作用于INS、Aktl、TNF、MAPK1、ESR1、F2、SERPINE1等142个潜在心血管疾病治疗靶点,参与甾类激素介导的信号通路、谷胱甘肽代谢过程、平滑肌细胞增殖的正调控、凝血等生物过程,调控凝血、炎症和免疫、内分泌等20条相关通路.结论 冠心宁注射液通过抗炎、抗氧化、抗凝、促纤溶、调节激素以及维持心血管功能稳态等药理作用治疗心血管疾病.
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hβ-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定
目的 构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础.方法 提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA.用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将hβ-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X- 1-β-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coliB L21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂耱珠亲和纯化表达的GST/β-arrestin1A、B,SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了β-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实:经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/β-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组β-arrestin 1A、B蛋白亚型的结合能力.结论 成功构建pGEX-5X -1 -β-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示β-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究β-arrestin1的生物学功能奠定了基础.
关键词： hβ-arrestin1 克隆 重组亚型表达 蛋白互作 -
酵母双杂交研究小鼠肝脏再生TGF-β调控通路中相关转录因子的相互作用
目的 采用酵母双杂交系统研究肝脏再生调控途径转化生长因子β(TGF-β)信号通路中4种转录因子的相互作用.方法 经CCl4腹腔注射诱导建立小鼠肝损伤再生模型,提取模型小鼠肝脏组织总RNA作为模板,经RT-PCR获得cDNA.经肝脏再生基因芯片检测显示差异表达且与TGF-β信号通路相关的激活转录因子3(ATF3)、DNA结合抑制因子3(ID3)、DNA损伤诱导的转录因子3(DDIT3)和LIM蛋白家族成员FHL2(FHL2)作为候选基因,进行基因克隆和载体构建,PCR及DNA测序鉴定.采用酵母双杂交系统进行自激活检测实验和酵母双杂交实验,观察ATF3、FHL2、DDIT3和ID3之间的相互作用.结果 PCR及DNA测序鉴定表明,ATF3、FHL2、DDIT3、ID3基因克隆与载体构建成功.自激活检测显示ATF3、FHL2、DDIT3和ID3不存在自激活现象;酵母双杂交实验发现7对蛋白互作,分别为ID3/ATF3、FHL2/ATF3、ATF3/ATF3、FHL2/FHL2、ID3/FHL2、ID3/ID3和ID3/DDIT3.结论 ATF3、FHL2和ID3间的蛋白互作可能对TGF-β信号通路具有调控作用;蛋白互作网络可作为肝损伤再生机制研究的途径之一.
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酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究
目的 建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法.方法 采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定佳酶活测定条件. 结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)＞8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109 中差异有统计学意义(P＜0.001),而在Y187中没有明显差异(P＞0.05). 结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定.
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酵母双杂交技术筛选与蛋白激酶Wee1相互作用的蛋白
目的 应用酵母双杂交技术筛选出与Wee1蛋白激酶相互作用的候选分子,为进一步研究Wee1的分子功能提供理论基础.方法 利用分子克隆的方法重组酵母双杂交质粒pGBKT7-Wee1,并验证其在酵母中的毒性、自激活能力和表达.利用酵母双杂交技术从人卵巢cDNA文库中筛选出与Wee1蛋白相互作用的蛋白,并在酵母中重新验证其相互作用.结果 成功构建pGBKT7-Wee1诱饵质粒,验证了其无毒性及自激活能力,且可以在酵母中表达,可进一步进行酵母双杂交的筛选工作.结论 利用酵母双杂交系统筛选出与Wee1相互作用的候选分子30个,为揭示蛋白激酶Wee1可能通过与其他蛋白相互作用进而调控细胞周期进程.
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增液汤的网络靶标预测及作用机制研究
目的 采用网络药理学方法对增液汤中活性成分的作用机制进行分析,探讨其成分、靶点及通路间的相关关系.方法 运用中药系统药理学成分分析平台(BAT-MAN)数据库获取增液汤的作用靶标基因,采用Cytoscape 3.5.1软件构建活性成分-靶点网络,STRING平台构建靶蛋白互作网络,利用BiNGO和MCODE插件对相互作用的靶基因进行GO生物过程富集和聚类分析,借助生物学信息注释数据库对靶点进行KEGG信号通路分析.结果 增液汤中23个药效成分作用于268个潜在靶点,聚类分析862个GO生物过程得到物质合成代谢、氧化应激、细胞离子平衡、炎症反应、凝血调节等23个子簇.KEGG信号通路富集主要涉及代谢、神经递质、氨基酸合成、信号转导、心血管和其他等6大类22条信号通路.结论 本研究揭示了增液汤活性成分、靶点及多维药理作用机制,为其临床治疗价值拓展提供新的线索.
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基于网络药理学的枳术汤活性成分-靶点-通路研究
目的 运用网络药理学研究枳术汤活性成分-靶点-通路,明确其药理机制.方法 利用中药分子机制生物信息学分析平台获取枳术汤活性成分及对应靶点;利用STRING数据库构建PPI网络,依据度值和介数筛选关键靶蛋白;利用BiNGO和MCODE插件对靶基因进行GO生物过程富集和聚类分析;利用DAVID数据库分析靶点的KEGG信号通路.结果 获得辛弗林、N-甲基酪胺、白术内酯Ⅲ等16个主要活性成分及127个靶点,发现了MAPK1、DRD2、ADRB1、CHRM2、HTR、MAOB、DBH等30个关键靶点.聚类分析809个GO生物过程得到内环境、神经递质、中枢神经、心血管系统、炎症、激素、蛋白质代谢、核酸代谢等28个子簇.KEGG信号通路富集主要涉及神经递质、内分泌、信号转导、物质代谢及其他等5大类17条信号通路.结论 枳术汤活性成分作用于乙酰胆碱、多巴胺、5-羟色胺、肾上腺素等神经递质的受体及代谢酶,参与神经递质调节、心肌信号转导、内分泌等信号通路和生物过程,主治胃肠动力障碍性疾病,对心血管、神经系统疾病也具有一定药理作用.
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枳实芍药散“成分-靶点-通路”的网络药理学研究
目的 基于网络药理学研究枳实芍药散活性成分-靶点-通路及其药理机制.方法 利用网络药理学分析平台(BATMAN-TCM)获取枳实芍药散活性成分及其对应靶点;利用STRING平台构建蛋白互作网络(PPI),依据度值和介数筛选关键靶蛋白;利用BiNGO和MCODE插件对关键靶基因进行基因本体(GO)生物过程富集和聚类分析;利用DAVID数据库分析靶点的京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路.结果 获得辛弗林、D-柠檬烯、N-甲基酪胺、没食子儿茶素、芍药新苷等26个主要活性成分及143个靶点,发现了DRD2、MAPK1、CHRM2、TNF、PTGS2、SLC18A2等35个关键靶点.聚类分析418个GO生物过程得到解热抗炎、神经突触递质、蛋白质分泌运输、转录、细胞代谢调控等10个子簇.KEGG信号通路富集主要涉及神经递质、信号转导、肿瘤、物质代谢及其他等5大类22条信号通路.结论 枳实芍药散能作用于前列腺素内环氧合酶2、肿瘤坏死因子、乙酰胆碱受体、多巴胺受体、5-羟色胺受体、视黄酸受体α等靶点,参与抗炎、神经递质调节、抗肿瘤等生物过程和信号通路,对炎症、胃肠系统、神经系统及肿瘤疾病具有良好的药理作用.
