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重组HMGB1-A盒蛋白对小鼠单核细胞的抗炎作用
目的:观察高迁移率蛋白B1-A盒蛋白(HMGB1-Abox)对小鼠单核细胞系在脂多糖(LPS)刺激下表达HMGB1的影响和动态变化以及对炎性因子分泌的抑制作用.方法:利用克隆载体构建PET28a-HMGB1-Abox原核质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)诱导后经Ni~(2+)-NTA树脂亲和纯化得到目的蛋白;以不同浓度的重组HMGB1Abox蛋白作用于LPS刺激的小鼠单核细胞系RAW264.7,CCK8试剂盒检测其对小鼠单核细胞活力的影响.以PBS和重组HMGB1-Abox蛋白为对照组和实验组,于2、6、12、24、48小时检测其细胞上清中的TNF-α、IL-1β的含量,Western blot、免疫荧光法观察细胞中HMGB1的表达、RT-PCR检测细胞中HMGB1-mRNA变化趋势.结果:成功构建PET28a-HMGB1-Abox原核质粒并纯化出大约为14 kD的目的蛋白.小鼠单核细胞活力与重组HMGB1-Abox蛋白浓度及作用时间呈正相关;实验组细胞上清TNFα、IL-1β的含量较对照组显著下降;Western blot及免疫荧光检测提示实验组细胞中HMGB1表达不断减少;细胞中HMGB1-mRNA含量及峰值均较对照组显著减少且延后.结论:重组HMGB1-Abox蛋白可以显著减少小鼠单核细胞在受到LPS刺激时HMGB1的表达和分泌,从而有效的阻断HMGB1对其他早期炎性因子的促进作用,减少炎性因子的分泌,有较强的抗炎作用.
关键词： HMGB1-A盒蛋白 原核构建 蛋白纯化 小鼠单核细胞系 -
成纤维细胞生长因子23蛋白原核表达及条件优化
目的 制备具有生物学活性的可溶性重组人成纤维细胞生长因子23(FGF23),并探讨其佳诱导表达条件.方法 克隆FGF23和SUMO-FGF23两个cDNA序列,分别与原核表达载体pET3c与pET22b相连,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)和BL21 (DE3)宿主菌中,对FGF23表达的佳质粒和宿主菌组合进行筛选,并对Rosetta (DE3)/pET22b-SUMO-FGF23重组菌株的佳诱导表达条件进行优化.结果 只有pET-SUMO-FGF23的质粒和Rosetta(DE3)的组合有FGF23蛋白质表达;融合蛋白在16℃、0.4 mmol/L IPTG诱导19 h以可溶形式表达,且上清表达量占菌体总蛋白的28％.结论 本研究成功获得了高表达量及可溶性的重组FGF23,佳表达条件是16℃、0.4 mmol/L IPTG诱导表达19 h.
关键词： 重组成纤维细胞因子23 原核构建 诱导表达 条件优化
