首页 > 文献资料
-
携带外源基因的rAAV-2在人树突状细胞中的稳定表达
目的:观察2型重组腺相关病毒(rAAV-2)载体介导外源基因对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的感染效能.方法:采用激光共聚焦显微镜观察FTTC标记的rAAV-2进入DC的过程;用不同的感染复数(MOI)的rAAV-2-Luc和rAAV-2-GFP感染新分离的DC,荧光素酶(Luc)检测试剂盒检测Iuc的表达和流式细胞术(FACS)检测GFP表达细胞的百分率.结果:加入rAAV-2后80分钟就可见病毒吸附在DC膜上,至90分钟可完全进入细胞内;MOI为1×104vp/cell时就可检测到Luc的表达,并呈现出随着MOI的加大而提高的趋势,自MOI为5×105vp/cell起,再提高MOI值并不能明显增加luc的表达;rAAV-2介导外源基因感染DC48小时后就可检测到表达,从96～240小时表达水平无明显变化;GFP的表达率为5～18%.结论:rAAV-2介导外源基因能有效感染DC,感染的DC可稳定表达外源基因,rAAV-2载体体外遗传修饰的DC可以进一步用于ex vivo途径的免疫治疗研究.
-
rAAV2载体介导GFP基因转染树突状细胞
目的:在诱导人骨髓CD34+细胞分化成树突状细胞(dendritic cells,DCs)的基础上,探讨2型重组腺相关病毒(Type 2 recombinant adeno-associated virus,rAAV2)载体介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因转染DCs的条件.方法:采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34+细胞.在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34+细胞生成DCs,于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟,在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs.通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞,荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达.结果:人骨髓CD34+细胞经诱导分化后,在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征,流式细胞仪检测到DCs表型;荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0.45%,13.54%和0.25%.结论:本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34+细胞诱导分化成DCs,rAAV2/GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高,且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs.
