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氧分压变化对NK92细胞生存及黏附性的影响
目的:探讨体外培养环境中氧分压变化对NK92细胞迁移特性及相关基因表达的影响.方法:将NK92细胞株分别置于1%、5%、10%、15%及21%氧,5%CO2环境下培养6小时;采用流式细胞技术检测细胞活力,甲苯胺蓝法检测黏附能力;RT-PCR半定量技术检测迁移相关基因的表达.结果:不同氧分压条件下NK92细胞活率无显著区别;1%、5%、10%氧压下NK92细胞黏附促进率显著高于15%及21%氧压组(P＜0.05);10%氧压下NK92细胞CCR1、5、6、7及CXCR4 mRNA的水平显著高于常氧(21%O2)对照组(P＜0.05);低氧(1%O2)显著下调NK92细胞CCR5、7、CX3CR1及CXCR4基因的表达,上调HIF-1α及CCR1基因的表达.结论:体外培养环境中氧分压变化能影响NK92细胞黏附性及相关基因表达的变化,但不影响其生存;NK92细胞低氧环境下生存可能与HIF-1α及CCR1基因表达上调有关.体外细胞功能及药物效应的研究不仅要考虑模拟体内的CO2浓度,还应考虑氧环境因素对细胞的影响.
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靶向CD33的CAR修饰的NK92细胞对CD33+急性髓系白血病细胞的杀伤作用
目的:根据抗CD33-scFv序列构建CD33-CAR修饰的NK92细胞,探讨其对CD33+急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞的杀伤作用.方法:通过基因合成以及分子克隆技术获得抗CD33-CAR片段,然后将其构建到慢病毒载体上,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染NK92细胞,用流式细胞术检测细胞转染效率并通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达抗CD33-CAR的细胞系CD33-CAR-NK92,利用钙黄绿素释放法检测该细胞的杀伤作用,ELISA法检测细胞因子IFN-γ分泌的变化.结果:成功构建pCDH-CD33-CAR重组慢病毒质粒,慢病毒转导后约18.7％的NK92细胞表达CD33-CAR(命名为CD33-CAR-NK92细胞),嘌呤霉素筛选后表达CD33-CAR的NK92细胞比例约86.3％.CD33-CAR-NK92细胞对CD33+AML细胞MOLM-13的杀伤作用明显高于未被基因修饰的NK92细胞(P＜0.01),而两者对CD33-肿瘤细胞JURKAT的杀伤作用没有明显差异(P＞0.05).效靶比为2∶1共培养6h后,经CD33-CAR修饰的NK92细胞相比未被基因修饰的NK92细胞IFN-γ的分泌水平明显升高[(190.97±11.52)vs(88.41±2.75)pg/ml,P＜0.01].结论:CD33-CAR-NK92细胞能特异性识别CD33抗原并杀伤CD33+AML细胞,其杀伤作用显著高于未被基因修饰的NK92细胞,为进一步开展靶向CD33的CAR-NK92细胞治疗AML的临床转化奠定了实验基础.
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5-氟尿嘧啶增强HeLa细胞对自然杀伤细胞敏感性研究
目的 用5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)处理HeLa细胞,检测其NKG2D 配体 MICA 的表达及其对NK92细胞杀伤敏感性的变化.方法 不同浓度的 5-FU处理 HeLa细胞,在不同时间点用半定量PCR及流式细胞术检测HeLa细胞表面的NKG2D配体MICA在RNA及蛋白水平的表达变化情况,用MTT法检测NKG2D抗体封闭NK92细胞的NKG2D受体前后, NK92 细胞对HeLa细胞的杀伤作用.结果 不同浓度的5-FU作用于 HeLa 细胞后,半定量RT-PCR结果显示MICA表达随5-FU作用浓度增加逐渐增高.而且40 μg/ml 5-FU作用于HeLa细胞后随着作用时间的延长(0、8、16、24 h)MICA表达增加,流式细胞术检测结果表明,MICA表达的增加主要依赖于未凋亡细胞的 MICA表达.在40μg/ml 5-FU作用24 h,效靶比为2.5∶ 1,5∶ 1,10∶ 1,20∶ 1时都检测到NK92细胞对HeLa细胞的杀伤增强,杀伤作用可部分被NKG2D抗体抑制.结论 5-FU 能够上调HeLa细胞表面NKG2D配体MICA的表达,增强HeLa细胞对NK92细胞的敏感性,提示化疗联合NK细胞免疫治疗宫颈癌可产生协同作用,提高治疗效果.
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NK92细胞经非溶酶体途径快速生成并释放35 kD颗粒酶B至靶细胞
目的 探讨NK92细胞能否经非分泌型溶酶体途径分泌颗粒酶B(GZB)以及其可能的分泌机制.方法 NK92细胞作为细胞模型,经佛波酯(PMA)和离子霉素(ION)活化后4h内,采用免疫荧光染色和胶体金标记免疫电镜技术检测NK92细胞胞质中蛋白合成功能被抑制前后相对分子质量(Mr)35 000和32 000 GZB的含量及其分布情况;采用Westem blot法检测分离纯化分泌型溶酶体(SL)及不含溶酶体胞质中的GZB种类;通过EDTA抑制溶酶体的胞吐来阻断Mr32 000 GZB的释放,观察活化后NK92细胞上清中的Mr35 000 GZB含量;将活化的NK92细胞与K562细胞共培养,观察Mr35 000 GZB能否进入K562细胞;观察活化后NK92细胞的死亡率,并检测其分泌Mr35 000 GZB的酶活性.结果 NK92细胞PMA/ION刺激4h后,在SL外的胞质中生成大量GZB,Mr为35 000区别于SL内GZB的Mr32 000.经免疫电镜和免疫荧光染色进一步显示,这些GZB位于溶酶体外的小囊泡内.同时,Mr35 000 GZB能被分泌至细胞外.进一步检测发现受到刺激的NK92细胞在SL外的胞质中同时出现GZB/丝氨酸蛋白酶抑制剂9(serpinb9)复合物以及Mr35 000 GZB,但死亡率未上升,与之相应的是SL内的GZB具有酶活性,SL外的Mr35 000 GZB为酶原形式,表明Mr35 000 GZB并非由SL漏出.结论 人NK细胞内存在SL外无酶活性的Mr 35 000 GZB,以非溶酶体途径快速生成方式分泌至细胞外,提供了部分细胞外的GZB.
