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TNF受体胞外区在RBL-2H3肥大细胞中表达及分泌后的生物活性
检测TNF受体胞外区在RBL-2H3细胞中表达及分泌后的生物活性.用I型TNF受体(TNFR1)胞外区的表达载体转染RBL-2H3细胞,用免疫荧光技术检测TNFR1的亚细胞定位,通过诱导IgE受体交联诱导细胞脱粒,用免疫沉淀结合SDS-PAGE检测TNFR1,用TNF-α敏感细胞株WEHI细胞检测分泌的TNFR1的生物活性.免疫荧光结果显示RBL-2H3细胞的分泌型溶酶体中存在TNFR1,免疫沉淀结果显示TNFR1在RBL-2H3细胞脱粒中释放,对WEHI细胞的TNF-α毒性实验显示分泌的TNFR1具有降低TNF-α细胞毒的作用.提示在RBL-2H3细胞中表达及分泌的TNFR1具有结合TNF-α的生物活性,能够降低TNF-α的细胞毒作用.
关键词： I型TNF受体(TNFRl) TNF-α 分泌型溶酶体 脱粒 -
NK92细胞经非溶酶体途径快速生成并释放35 kD颗粒酶B至靶细胞
目的 探讨NK92细胞能否经非分泌型溶酶体途径分泌颗粒酶B(GZB)以及其可能的分泌机制.方法 NK92细胞作为细胞模型,经佛波酯(PMA)和离子霉素(ION)活化后4h内,采用免疫荧光染色和胶体金标记免疫电镜技术检测NK92细胞胞质中蛋白合成功能被抑制前后相对分子质量(Mr)35 000和32 000 GZB的含量及其分布情况;采用Westem blot法检测分离纯化分泌型溶酶体(SL)及不含溶酶体胞质中的GZB种类;通过EDTA抑制溶酶体的胞吐来阻断Mr32 000 GZB的释放,观察活化后NK92细胞上清中的Mr35 000 GZB含量;将活化的NK92细胞与K562细胞共培养,观察Mr35 000 GZB能否进入K562细胞;观察活化后NK92细胞的死亡率,并检测其分泌Mr35 000 GZB的酶活性.结果 NK92细胞PMA/ION刺激4h后,在SL外的胞质中生成大量GZB,Mr为35 000区别于SL内GZB的Mr32 000.经免疫电镜和免疫荧光染色进一步显示,这些GZB位于溶酶体外的小囊泡内.同时,Mr35 000 GZB能被分泌至细胞外.进一步检测发现受到刺激的NK92细胞在SL外的胞质中同时出现GZB/丝氨酸蛋白酶抑制剂9(serpinb9)复合物以及Mr35 000 GZB,但死亡率未上升,与之相应的是SL内的GZB具有酶活性,SL外的Mr35 000 GZB为酶原形式,表明Mr35 000 GZB并非由SL漏出.结论 人NK细胞内存在SL外无酶活性的Mr 35 000 GZB,以非溶酶体途径快速生成方式分泌至细胞外,提供了部分细胞外的GZB.
