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miR-508-5p慢病毒过表达载体构建及对MAPK1/ERK信号通路靶向抑制作用的研究
目的:构建能高效表达成熟miR-508-5p小分子的慢病毒过表达载体,研究其对MAPK1/ERK信号通路靶向调控作用.方法:利用化学合成miR-508-5p茎环结构RNA,并将其克隆入线性化的pSicoR 质粒中,经双酶切及测序鉴定;同时构建与miR-508-5p互补靶基因MAPK1的3'非翻译区,将其克隆入线性化的Report载体中.利用脂质体转染试剂将鉴定阳性的pSicoR-miR-508-5p重组质粒转染HEK-293T细胞,进一步通过Relative luciferase activity、Western blot及real-time PCR试验检测MAPK1蛋白和mRNA相对表达水平.结果:酶切及测序结果证明成功构建pSicoR-miR-508-5p 及Report-MAPK1 3'-UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05);抑制miR-508-5p的表达,又明显上调MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05).结论:成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实miR-508-5p直接靶标MAPK1的表达,在转录后水平对其进行负调控,为进一步研究miRNA对细胞通路和细胞周期的调控作用奠定了基础.
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miR-508-5P慢病毒过表达载体的构建及对S期激酶相关蛋白2靶向调控作用
目的 构建miR-508-5p慢病毒过表达载体,探讨其对SKP2基因的靶向调控作用.方法 基于化学法合成miR-508-5p茎环结构RNA,将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组体转染至HEK293T细胞;同时构建与miR-508-5p互补靶基因SKP2的3 '非翻译区(3'UTR),将其克隆入线性化的pMIR-Report载体中.通过相对荧光素酶活性、Western blot法及实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法验证miR-508-5p与SKP2 3'UTR的靶向调控关系.结果 经PCR、酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-508-5p及pMIR-Report-SKP2-3'UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P＜0.05);抑制miR-508-5p的表达,则明显上调SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P＜0.05).结论 成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实通过靶向作用于SKP2-3' UTR的特异序列直接抑制SKP2基因的表达.
关键词： microRNA miR-508-5P S期激酶相关蛋白2
