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新型肿瘤坏死因子免疫抑制剂的克隆和表达
目的:用鸡卵清溶菌酶(hen egg-white lysozyme,HEL)T辅助细胞表位序列替换新型rhTNF-α3'末端序列,构建和表达新型rhTNF-α免疫抑制剂.方法:克隆、表达、纯化和鉴定新型rhTNF-α免疫抑制剂.结果:DNA测序表明,重组新型hTNF-αHEL的3'末端序列与设计序列完全相同.将其转移到pBV220表达载体中,重组菌经42℃诱导后做SDS-PAGE分析,结果显示该重组体获得了表达,其表达量为菌体总蛋白量的30%,表达形式为包涵体,对该包涵体进行溶解和复性,再经阴离子交换柱纯化,获得的重组蛋白的纯度可达90%以上.免疫印迹鉴定结果证实,该表达蛋白可与抗TNF-α抗体产生免疫反应.体外杀伤活性检测显示,该蛋白已完全丧失了新型TNF-α的体外杀伤活性.结论:上述实验证实,新型rhTNF-α免疫抑制剂构建成功,该免疫抑制剂既保持了与TNF-α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性,为其下一步治疗作用的研究打下了基础.
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肿瘤坏死因子新型免疫抑制剂的构建、表达和鉴定
目的用鸡卵清溶菌酶(Hen egg-white lysozyme,HEL)T辅助细胞表位序列替换hTNF-α3'末端序列,构建和表达hTNF-α新型免疫抑制剂.方法将重组的hTNF-α HEL克隆、表达、纯化后进行初步的生物学活性鉴定.结果DNA测序分析表明,重组的hTNF-α HEL3'末端序列与设计序列完全相同.将其插入pBV220表达载体中,重组菌经42℃诱导4 h做SDS-PAGE分析,结果显示该免疫抑制剂获得了表达,Mr为17 000,其表达量为菌体总蛋白量的30%.Western blot结果证实,该表达蛋白可与抗TNF-α抗体产生免疫反应.对该表达蛋白进行了阴离子交换柱纯化,获得的重组蛋白的纯度可达95%以上.对该蛋白的体外杀伤活性检测表明,该蛋白已完全丧失了TNF-α的体外杀伤活性.结论上述实验结果证明,TNF-α免疫抑制剂的构建获得了成功,该免疫抑制剂既保持了与TNF-α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性,为其下一步治疗作用的研究奠定了基础.
