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ACTH单克隆抗体的制备和鉴定
ACTH是垂体分泌的重要激素之一，测定血浆ACTH对下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的评 价 具有重要意义。制备ACTH单克隆抗体，以期建立ACTH-IRMA方法。 ACTH或其片段与BSA经碳化二亚 胺偶联剂联接后制备免疫原，初次免疫为完全福氏佐剂乳化后在背部皮下多点注射，ACTH剂 量约40 μg，以后每隔4 w以不完全福氏佐剂乳化后在背部或腹腔交替注射4～6次，剂量减 半 。融合前3 d每天以无佐剂的ACTH联接物行腹腔注射，总剂量为60 μg。按常规方法进行细 胞融合，每周换液2至3次。阳性克隆的筛选：培养上清液抗体检测按常规RIA进行，计算结 合率，以结合率大于3倍的非特异结合率为阳性。阳性孔经有限稀释法亚克隆3～4次后获得 2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,5G2为ACTH1-28片段所得,D3为ACTH1-13片 段所得。扩增 细胞，一部分冻存，另一部分种于已致敏的BALB/c小鼠腹腔产生含抗体的腹水。收集的腹水 稀释后，以RIA法测定各稀释点抗体的结合率,计算5G2和D3腹水抗体在50%结合率时的终稀 释度分别可达1:5 000和1:2 000。以 1%琼脂双扩（梅花孔）法作抗体亚类鉴定，5G2和D3抗 体 均为IgG1类型,轻链为λ链。根据标准曲线参数，通过公式6y0/(1- y0)(2- y0)(4- y0)( 3ED50-ED25) 计算5G2和D3抗体的亲和常数分别为5.1×109和4.9 ×107 M-1。以ACT H不同片段作 交叉反应试验，进行特异性鉴定。5G2和D3抗体与ACTH1-10、ACTH1-17、 ACTH1-24的交叉反 应率分别为0.04%、8.70%、100.00%和0、35.30%、69.30%。据此推断5G2抗体识别ACTH 氨基酸序列 的17～28片段,D3抗体识别ACTH氨基酸序列的10～13片段。 以羊抗鼠IgG-Sephadex G75偶 联 物层析柱,进行腹水抗体的亲和纯化。按本室的方法将纯化的5G2和D3抗体分别包被马来酸酐 -苯乙烯共聚物塑料管,制备固化抗体管,以125I-ACTH做固相放免, 通过大结合率 确定5G2和D3抗体的饱和结合量分别为5 μg和20 μg，为建立固相IRMA奠定了基础。 ACTH是 垂体分泌的39肽分子，由于ACTH分子量小，在体内半衰期短；ACTH氨基酸序列只在第26至 33之间有3个氨基酸残基有种属差异，小鼠的免疫细胞不易识别，终导致小鼠不易产生抗 体。在本实验中只有18.3%的小鼠血清抗体阳性，而且抗体滴度不高。我们经过反复筛选获 得的2株抗体分别识别ACTH氨基酸序列的第17～28片段和第10～13片段，其亲和常数分别达 109和107 M-1, 用于液相放射免疫分析不足以达到理想的灵敏度，据文 献报道使用2个单 克隆抗体，建立IRMA方法，则灵敏度可显著提高。由于这2株单抗识别的位点不同,有望建 立ACTH-IRMA方法。
