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用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞
制备单克隆抗体一个必不可少的步骤就是使融合后的细胞进行单克隆培养.融合细胞的克隆化方法主要采用有限稀释法[见:徐新来.细胞培养在杂交瘤技术中的应用.见:鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1995:207~214].由于需要反复克隆再克隆,细胞培养的工作量大,操作繁琐,克隆效率低.我们采用甲基纤维素制成半固体培养基可以克服以往方法上的局限性,直接进行克隆化的培养,提高了工作效率.
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克隆法研究γ射线诱发人外周血淋巴细胞HPRT基因突变
目的用克隆法研究γ射线诱发的人外周血淋巴细胞HPRT基因突变情况.方法从一健康成年男子外周血中分离出淋巴细胞,种于96孔板,进行淋巴细胞的克隆和HPRT基因突变细胞的筛选.结果在一定剂量范围内,人外周血淋巴细胞克隆率与照射剂量呈负相关,相关模型为y=49.8100-4.4655D,r2=0.9662(P<0.05);HPRT基因突变频率与照射剂量呈正相关,相关模型为y=0.0958+1.5501D,r2=0.9878(P<0.05).结论淋巴细胞HPRT基因对辐射敏感,在一定剂量范围内,HPRT基因突变频率与照射剂量呈正相关.
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一种提高PCR产物亚克隆效率的方法
利用PCR扩增目的基因是常用的一种克隆方法,但在实际操作中,试剂盒中Taq DNA聚合酶在经过各种纯化方法(如酚氯仿抽提,乙醇沉淀,电泳和柱纯化)后,仍附着在扩增产物的5'端,有效地阻止随后的内切酶酶切过程,导致重组的失败。作者采用一种可以显著提高PCR产物克隆的效率的方法,即将10 μl蛋白酶K混合物[蛋白酶K混合物的配制:0.1 mol/LTris-HCl (pH8.0)、5%SDS,0.5 mg/ml蛋白酶K)加入100 μl PCR反应后的产物中,37 ℃水浴1 h后,68 ℃ 15 min以灭活蛋白酶K,用酚-氯仿、氯仿各抽提1次,无水乙醇沉淀,70%乙醇清洗后晾干,并用双蒸水溶解。采用这种方法得到了PCR产物与相应酶切载体连接,可以顺利得到大量的重组子,与常规方法比较大大地提高了克隆的效率。