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α7神经型尼古丁受体激动剂PNU282987对小鼠海马组织突触相关蛋白的影响
目的 探讨特异性激动小鼠α7神经型尼古丁受体(α7nAChR)水平对海马组织中突触相关蛋白表达的影响.方法 选取6月龄非转基因C57雄性小鼠32只,随机分为对照组(Control),腹腔注射0.5、1.0 mg/kg、3.0 mg/kg PNU282987组各8只.采用Real-time PCR法和蛋白免疫印迹(Western印迹)法分别测定小鼠海马组织中囊泡相关蛋白突触素(Syn)、突触小体相关蛋白(SNAP)-25和突触后致密物(PSD)-95 mRNA及蛋白表达水平的变化.结果 与对照组相比,1.0 mg/kg PNU282987组、3.0 mg/kg PNU282987组中突触相关蛋白Syn、PSD-95、SNAP-25的mRNA和蛋白表达水平均显著增高.结论 特异性激动小鼠α7nAChR能够使海马组织中突触相关蛋白水平表达增加.这可能提示了α7nAChR与突触密切相关,这可能与其神经保护作用有关.
关键词： α7神经型尼古丁受体 突触 -
SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因过表达对钙调蛋白表达的影响
目的 构建稳定的α7神经型尼古丁受体(α7 nAChR)过表达的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,研究α7 nAChR过表达对钙调蛋白(CaM)表达水平的影响.方法 设计α7 nAChR引物并扩增α7 nAChR 特异性编码的核苷酸序列,退火后克隆至pcDNA 3.1 质粒,构建α7 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒.将α7 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒转染SH-SY5Y细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用实时荧光定量(Real-time)PCR和蛋白质印迹方法检测转染细胞中α7 nAChR mRNA 及蛋白表达水平的变化,蛋白质印迹方法检测CaM表达水平的变化.结果 构建的α7 nAChR mRNA过表达质粒成功转入SH-SY5Y细胞后,经G418筛选获得稳定转染细胞克隆株,与对照组相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表达量分别增加了533％和110％,CaM表达量增加了43％.结论 成功构建了α7 nAChR mRNA过表达的SH-SY5Y细胞株,α7 nAChR表达上调增加了CaM表达水平,这可能与阿尔茨海默病的发病有一定的关系.
关键词： α7神经型尼古丁受体 钙调蛋白 SH-SY5Y细胞 -
α7神经型尼古丁受体基因抑制对SH-SY5 Y细胞Tau和配对螺旋样纤维蛋白1水平的影响
目的：探讨α7神经型尼古丁受体（nAChR）基因沉默对 SH-SY5Y 细胞 Tau 和配对螺旋样纤维蛋白（PHF）1水平的影响及α7 nAChR在阿尔茨海默病（AD）发病机制中的作用。方法 SH-SY5Y细胞转染α7 nAChR shRNA重组质粒，用实时荧光定量 PCR和 Western印迹法分别测定细胞中α7 nAChR在mRNA和蛋白表达水平的变化；用Western印迹法检测细胞Tau和 PHF1蛋白水平。结果α7 nAChR基因沉默组与空质粒组相比，α7nAChR mRNA 和蛋白质表达水平分别降低了94％（P＜0.01）和82％（P＜0.01）；Tau蛋白水平升高了65％（P＜0.01）；PHF1蛋白水平升高了58％（ P＜0.05）。结论α7 nAChR基因表达抑制后Tau和PHF1蛋白水平明显升高，Tau蛋白和PHF1蛋白表达增加直接促进神经元纤维缠结的形成，这可能与AD的病理进程有一定关系。
关键词： 阿尔茨海默病 Tau 配对螺旋样纤维蛋白1 α7神经型尼古丁受体 -
α7神经型尼古丁受体激动剂PNU282987对APP/PS1小鼠海马组织中DYN-Ⅰ蛋白表达的影响
目的 研究特异性激动APP/PS1转基因小鼠脑组织中α7神经型尼古丁受体(α7 nAChR)水平后对海马组织DYN-Ⅰ蛋白的影响;探讨α7 nAChR在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)发病机制中的神经保护作用机制.方法 实验动物分为对照组(Control)、野生加PNU282987组(WP)、APP/PS1转基因组(APP/PS1)和APP/PS1加PNU282987组(AP)各8只,WP和AP组给予α7 nAChRs特异性激动剂PNU-282987,另两组给予生理盐水,给药方式为小鼠24 w龄时1 mg/kg腹腔注射PNU-282987,连续5 d.采用Real-time PCR法和蛋白免疫印迹(Western Blot)法分别测定小鼠海马组织中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 与con-trol组相比,APP/PS1组海马组织中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白水平下降(P<0.05,P<0.01);而特异性激动α7 nAChR水平后,与对照组相比WP组中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白水平升高(P<0.05,P<0.01);与APP/PS1组相比AP组小鼠大脑海马组织中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.01,P<0.01).结论 特异性激动APP/PS1转基因小鼠海马组织中α7 nAChR水平能够使网格蛋白内吞调节蛋白DYN-Ⅰ表达升高.这可能提示了α7 nAChR对突触有一定的保护作用,进一步说明α7 nAChR在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用.
关键词： α7神经型尼古丁受体 阿尔茨海默病 APP/PS1转基因鼠 DYN-Ⅰ -
α7神经型尼古丁受体激动剂PNU282987对APP/PS1小鼠海马组织中AP180蛋白表达的影响
目的 探讨特异性激动APP/PS1转基因小鼠中的α7nAChR后其海马组织中突触后膜蛋白的表达变化.方法 选择16只经过鉴定的APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1组(APP/PS1)和APP/PS1+PNU282987组(AP),每组各8只;另选16只野生型小鼠随机分为对照组(Control)和野生+PNU282987组(WP),每组各8只.饲养小鼠达到24周龄后,AP组和WP组于每天进行Morris水迷宫行为学测试前4 h腹腔注射PNU282987(1 mg/kg/d),之后利用Morris水迷宫进行行为学测试,Real-time PCR及Western blotting法分别检测各组小鼠海马组织中AP180 mRNA及蛋白水平的表达情况.结果 与对照组比较,APP/PS1组海马组织中AP180 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.01,P<0.01);而特异性激动α7 nAChR水平后,WP组中AP180 mRNA和蛋白水平升高(P<0.01,P<0.05);与APP/PS1组相比AP组小鼠大脑海马组织中AP180 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.01,P<0.01).结论 特异性激动APP/PS1转基因小鼠海马组织中α7 nAChR能够使网格蛋白介导的突触囊泡内吞过程中的关键蛋白AP180表达水平升高.这可能提示了α7nAChR对突触有一定的保护作用,进一步说明α7nAChR在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用.
关键词： α7神经型尼古丁受体 阿尔茨海默病 APP/PS1转基因鼠 AP180 -
SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因沉默对CaM、CaMKⅡ蛋白水平的影响
目的 构建稳定的α7 nAChR沉默的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞,研究α7神经型尼古丁受体(nAChR)基因沉默对钙调蛋白(CaM)、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)水平的影响,了解α7 nAChR神经保护作用及其与阿尔茨海默病(AD)发病机制的关系.方法 将α7 nAChR shRNA重组质转染到SH-SY5Y,用含嘌呤霉素的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法(Western-blot)检测细胞中α7nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化;Western-blot方法测定CaM、CaMKⅡ蛋白表达水平.结果 获得稳定转染α7 nAChR shRNA重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表达量分别减少了95％和80％.CaM、CaMKⅡ蛋白表达量分别减少了48.5％和35％.结论 成功构建了α7nAChR mRNA沉默的SH-SY5Y细胞细胞株,α7 nAChR沉默降低了CaM、CaMKⅡ的蛋白水平,可能影响信号通路转导,这可能与阿尔茨海默病(AD)的发病有一定的关系.
关键词： RNA干扰 α7神经型尼古丁受体 CAM CaMKⅡ SH-SY5Y细胞 -
灯盏细辛活性部位对神经细胞α7尼古丁受体表达的影响
目的: 研究灯盏细辛活性部位对SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体 (nAChR)亚单位在蛋白质水平的表达以及对抗β-淀粉样蛋白的毒性作用.方法: 灯盏细辛经乙醇提取、乙酸乙酯及正丁醇萃取、再以反相硅胶柱分离等方式得到极性部位,选取一定浓度的灯盏细辛提取物处理神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后,用Western blotting方法测定α7 nAChR蛋白水平的变化;再将能明显上调α7 nAChR蛋白水平的灯盏细辛提取物预处理SH-SY5Y细胞后,加入Aβ25-35处理,用比色法测定MTT还原率,观察灯盏细辛活性部位对细胞毒性的影响.结果: 灯盏细辛醇提乙酸乙酯及正丁醇部位、以及该部位经反相硅胶柱分离的低极性部位均能显著上调α7 nAChR蛋白水平,并减弱β-淀粉样蛋白引起的细胞损伤.结论: 灯盏细辛活性部位具有一定的神经保护作用,其机制之一可能与上调α7 nAChR有关.
关键词： 灯盏细辛 α7神经型尼古丁受体 神经元 β-淀粉样蛋白 阿尔茨海默病 -
RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞α7神经型尼古丁受体基因的表达
目的:利用小分子干扰RNA(RNAi)技术抑制神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中α7 神经型尼古丁受体(nAChR)基因的表达,并研究α7 nAChR基因表达受抑制后对细胞存活率及脂质过氧化水平的影响.方法:设计并通过分子生物学方法合成α7 nAChR基因特异性小分子干扰RNA(siRNA),转染SH-SY5Y细胞,培养48 h后收集细胞,分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和西印迹方法(Western-blotting)检测转染细胞中α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化,并用1 μmol/L β淀粉样肽25-35(Aβ25-35)处理siRNA转染细胞,比色法测定脂质过氧化产物含量.四氮基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞活力.结果:转染siRNA后,与对照组相比,实验组α7 nAChR mRNA及蛋白表达量降低,抑制率分别为52%和36%,脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,MTT法表明实验组细胞活力明显低于对照组,且能增强Aβ的细胞毒性作用.结论:特异性siRNA能有效抑制α7 nAChR基因的表达,α7 nAChR基因的表达的抑制能增加Aβ的神经毒性作用,间接说明α7 nAChR有一定的神经保护作用,其表达减少与阿尔茨海默病的发生有一定关系.
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星形胶质细胞α7神经型尼古丁受体激动剂Nicotine和PNU对钙调蛋白水平的影响
目的：探讨星形胶质细胞α7神经型尼古丁受体（α7nAChRs）激动剂Nicotine和PNU对钙调蛋白（CaM）表达水平的影响。方法：第3~4代乳鼠大脑星形胶质细胞分为对照组和实验组，对照组不加α7nAChRs激动剂，实验组分别加入α7nAChRs激动剂Nicotine或PNU处理细胞，Nicotine或PNU的浓度为1、5及10μmol/L，处理时间为6、12、18及24 h；采用蛋白印迹（ Western blotting）方法检测Nicotine或PNU不同浓度及不同时间点细胞裂解液中的CaM蛋白水平。结果：5μmol/L Nicotine处理6、12、18及24 h和10μmol/L Nicotine处理12、18及24 h的星形胶质细胞裂解液中的CaM蛋白表达水平高于对照组（ P﹤0.05），其余Nicotine浓度和处理时间点星形胶质细胞裂解液中CaM蛋白表达水平虽略高于对照组，但差异无统计学意义（ P﹥0.05）；浓度为1、10μmol/L的PNU处理24 h，CaM蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（ P﹥0.05），其他浓度及时间点的CaM蛋白表达水平均高于对照组（ P﹤0.05）。结论：星形胶质细胞α7nAChRs的激活可以使CaM的蛋白表达水平增加。
关键词： 星形胶质细胞 α7神经型尼古丁受体 激动剂 钙调蛋白 阿尔茨海默病
