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SV40 LT基因诱导人骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 利用猿猴病毒40大T抗原(SV40 LT)基因异位表达建立永生化人骨髓间充质干细胞(hM-SCs)系.方法 使用含有SV40大T片段的重组质粒载体转染人原代骨髓间充质干细胞,经G418筛选,连续传代培养,通过形态学、免疫组织化学及PCR技术等方法对细胞系进行鉴定.结果 转染后骨髓间充质干细胞基本保持了原代细胞的表型特征、形态均一、多为梭形,呈漩涡状或放射状排列,有特征性表型.该系已培养5个月,超过36代.细胞免疫组化染色显示有SV40 LT的表达.结论 成功地构建了SV40 LT基因永生化的人骨髓间充质干细胞系,为其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了实验基础.
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正常大肠干细胞的条件永生化
目的:建立正常人大肠干细胞系.方法:用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞,以含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒感染,对其进行永生化;然后,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定.结果:用中性蛋白酶分级消化获得的AKP活性阴性的细胞群生长呈多角形.该细胞群转染含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒后8～12周出现上皮样细胞克隆,经细胞特性鉴定:PAS染色黏蛋白阳性,上皮细胞角蛋白pan、CK-8、CK-19均阳性;用ELISA-PCR法检测该细胞第12代和第43代端粒酶活性,分别为0.43、0.83;用Western blot法检测发现该细胞系表达端粒酶和SV40大T抗原;用RT-PCR检测示该细胞株表达Musashi-1 mRNA;以1×106细胞数接种裸鼠,观察4个月无肿瘤形成,软琼脂克隆试验培养无转化细胞克隆出现.结论:建立的正常的大肠干细胞系具有干细胞特征,可作为体外研究致癌剂/促癌剂作用机制的较理想实验靶点.
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重组SV40大T抗原慢病毒表达载体的构建
目的 构建含有重组SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,转染真核细胞Eca-9706并检测SV40大T抗原基因在真核细胞内的表达.方法 以PCR方法从含有SV40大T抗原基凶的质粒上扩增出SV40大T抗原基因作为靶基因;将其连接至pGEM-T Easy载体上,并对靶基因进行DNA测序确认;再将靶基因与慢病毒表达载体pLentiGFP重组构建成为PLentiGFP-Tag;以脂质体介导转染真核细胞Eca-9706,观察慢病毒表达载体所携带的GFP基闪在细胞内的表达,使用RT-PCR检测SV40大T抗原基因在细胞内的表达水平.结果 成功克隆SV40大T抗原基因,经由DNA测序确认;成功筛选出含SV40大T抗原基因正插子的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag;转染真核细胞Eca-9706后48 h,观察到绿色荧光的广泛表达并检测出宿主细胞内高效表达的SV40大T抗原mRNA.结论 成功构建含SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,并观察到SV40大T抗原在真核细胞中的成功表达.
