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新基因s-lap编码区的克隆及其重组表达质粒PHB/s-lap的构建
目的:克隆新基因s-lap编码区序列并构建其重组表达质粒.方法:利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,以可见光损伤早期的培养的猪视网膜色素上皮(RPE)细胞ds cDNA为模板,扩增新基因s-lap编码区序列;利用基因重组技术构建PHB/s-lap重组表达质粒.结果:经测序证实获得了正确的新基因s-lap编码区序列,酶切鉴定及DNA序列分析表明已经将s-lap基因编码区序列克隆到PHB表达载体, 成功地构建了PHB/s-lap重组表达质粒.结论:成功地克隆了新基因s-lap编码区序列,并构建了其重组表达质粒PHB/s-lap.
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RPE细胞光损伤相关新基因s-lap编码区克隆及s-lap/GFP融合蛋白在B16黑色素瘤细胞中的表达与定位
目的克隆新基因s-lap编码区序列,研究其编码的蛋白质在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位.方法分析s-lap cDNA序列,建立视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞光损伤模型,RT-PCR克隆其编码区序列,构建了带有绿色荧光蛋白的目的基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-GFP/s-lap,转染B16黑色素瘤细胞,观察s-lap/GFP融合蛋白在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位.结果 s-lap cDNA序列含有编码101个氨基酸的开放读码框架,有2个可能的N-糖基化位点,1个可能的casein kinase II 磷酸化位点和2个可能的 PKC磷酸化位点;成功地克隆了s-lap蛋白编码区序列,构建了其真核表达载体,荧光显微镜观察,在转染pcDNA3.1-GFP质粒的B16黑色素瘤细胞中,荧光呈网状分布于细胞浆内,而细胞核内低表达;在转染s-lap/GFP融合基因的B16黑色素瘤细胞中,荧光均匀分布于整个细胞,尤其以细胞核内高表达.结论新基因s-lap编码的蛋白质可在B16黑色素瘤细胞中获得表达,并以细胞核内高表达.
