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胶质母细胞瘤干细胞的分离、培养及其生物学特性
目的:从人胶质母细胞瘤SC 326和SC 189细胞株分离培养于细胞,研究其自我更新、增殖和分化等生物学特性.方法:用无血清培养基培养人胶质母细胞瘤SC 326和SC 189细胞,检测细胞形成神经球的能力.对培养3代以上的细胞(GSC)进行神经球细胞单细胞克隆形成率实验；用第3代和第7代的细胞评价神经球单细胞克隆形成率；免疫荧光染色法检测神经球细胞的干细胞标记物表达及多向分化能力.结果:无血清培养基培养24 h时SC 326、SC 189形成神经球样细胞团,1周时神经球内细胞可达数百个,3代内神经球细胞SC 326的增殖率为(2.10±4.33)％、(4.03±4.14)％和(6.91±5.12)％,SC 189为(12.79±2.32)％、(15.78±3.25)％和(37.91±4.58)％；单细胞克隆形成率GSC 326和GSC 189分别为5.56％和8.33％,次级单细胞克隆形成率分别为9.89％和14.58％; GSC 326 P3和P7神经球克隆形成率大值为(12.67±2.86)％和(20.44±1.73)％,GSC 189 P3和P7神经球克隆形成率大值为(32.00±1.00)％和(42.67±5.03)％.免疫荧光染色,干细胞表面标记物CD133和神经巢蛋白呈强阳性表达,分化标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性类β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)表达极弱.分化诱导后分化标记物GFAP和β-TubulinⅢ的表达呈阳性.结论:早期原代胶质母细胞瘤细胞株中存在少量具有自我更新、增殖和多向分化能力的细胞,这些细胞具有明显的干细胞特性.
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微小RNA-203抑制胶质母细胞瘤干细胞的干细胞特性
目的 培养胶质母细胞瘤干细胞,观察微小RNA (miR)-203对其干细胞的影响,探讨其在胶质母细胞瘤基因治疗中的应用.方法 体外原代培养胶质母细胞瘤组织,免疫磁珠法分选CD133+细胞;免疫荧光染色检测分选后细胞CD133、巢蛋白(Nestin)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP2)的表达.将人miR-203模拟体和无意义寡核苷酸链(NC)分别转染胶质母细胞瘤干细胞作为miR-203组、NC组,用成球试验检测miR-203对胶质母细胞瘤干细胞自我更新能力的影响.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫荧光染色分别检测两组细胞CD133、Nestin、GFAP、MAP2的mRNA和蛋白的表达.结果 培养的胶质母细胞瘤干细胞表达干细胞标记物CD133、Nestin,分化后细胞表达星形胶质细胞的标志物GFAP、神经元的标志物MAP2;转染后7d,当NC组细胞球数目为100％时,miR-203组一、二次球数目分别为(67.84±13.79)％和(30.53±8.91)％,差异均有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR结果显示与NC组比较,miR-203组细胞CD133mRNA的相对表达水平为0.29±0.15,nestin mRNA为0.27±0.18;GFAP、MAP2mRNA表达升高,分别为7.89±3.99和2.59±1.16,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-203可以抑制胶质母细胞瘤干细胞的自我更新能力并促进其多向分化,可能成为新的针对胶质母细胞瘤的治疗策略.
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微小RNA-203在胶质母细胞瘤干细胞中的表达及其对细胞增殖的影响
目的 培养胶质母细胞瘤干细胞,检测微小RNA-203(miR-203)在胶质母细胞瘤干细胞中的表达,并观察其对肿瘤干细胞增殖的影响.方法 对胶质母细胞瘤组织行体外原代培养,以CD133为标志物,免疫磁珠法分选胶质母细胞瘤干细胞;免疫荧光染色检测分选所得细胞的CD133、巢蛋白(nestin)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP2)的表达,从而鉴定肿瘤干细胞.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分选后CD133+细胞、CD133-细胞miR-203的表达;将miR-203模拟体和无意义寡核苷酸链(NC)分别转染胶质母细胞瘤干细胞作为miR-203、NC组,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染后24、48、72、96、120 h细胞生存率;流式细胞仪细胞检测转染后3d细胞凋亡率.结果 培养的胶质母细胞瘤干细胞成球样生长,表达干细胞标志物CD133、Nestin,分化后细胞表达星形胶质细胞的标志物GFAP、神经元的标志物MAP2;分选后CD133+细胞中miR-203的表达低于CD133-细胞;转染miR-203后24、48、72、96、120 h组的细胞生存率均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);流式细胞仪检测显示miR-203组的细胞凋亡率为(9.74±2.81)％,高于NC组的(3.95±0.91)％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 上调miR-203可能成为针对胶质母细胞瘤干细胞的基因治疗策略.
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靶向治疗脑胶质母细胞瘤干细胞研究小鼠模型的建立
目的 通过置入微量渗透压泵,建立符合靶向治疗脑胶质母细胞瘤干细胞研究需要的在体模型,为靶向抑制剂的在体研究提供实验基础. 方法 近交系雌性SCID小鼠10只,于右侧室管膜下区立体定向接种5 μL人脑胶质母细胞瘤干细胞株(ESQ RT+TMZ)(2× 104个/μL)并安装可以持续输注的微量渗透压泵.观察小鼠的生存状态和濒死期症状出现的时间.处死小鼠,取出全脑大体标本观察并测定肿瘤直径,HE染色观察肿瘤的病理特征. 结果 10只小鼠全部存活,能够耐受2次连续手术操作,在大体标本及组织学检查中均发现肿瘤形成,致瘤率100％,肿瘤大横截面直径达(5.10±0.52) mm,且成瘤速度和形态均一、状况稳定,平均生存期(48.4±4.9)d,具备可重复性.HE染色显示组织病理学特点接近人脑胶质母细胞瘤病理特征. 结论 采用微量渗透压泵进行精准输注的方式成功建立符合靶向治疗脑胶质母细胞瘤干细胞研究需要的在体模型,为靶向抑制剂抗肿瘤的在体实验提供了基础.
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MiR-153对胶质母细胞瘤干细胞生物学特性的影响
目的 培养胶质母细胞瘤干细胞,观察microRNA(miR)-153对其生物学功能的影响,探讨其在胶质母细胞瘤基因治疗中的应用. 方法 体外原代培养胶质母细胞瘤组织,免疫磁珠法分选CD133+细胞;免疫荧光染色检测分选后细胞CD133、巢蛋白(nestin),分化后细胞神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP2)的表达进行鉴定.RT-PCR检测分选后CD133+细胞、CD133-细胞miR-153的表达;将人miR-153模拟体和无意义寡核苷酸链(NC)分别转染胶质母细胞瘤干细胞作为miR-153、NC组,7d后用成球试验检测miR-153对胶质母细胞瘤干细胞自我更新能力的影响.RT-PCR、免疫荧光染色分别检测2组细胞CD133、nestin、GFAP、MAP2 mRNA和蛋白的表达.转染后24、48、72、96和120 h CCK-8法检测2组细胞存活率.转染后3d流式细胞仪检测2组细胞凋亡率. 结果 培养的胶质母细胞瘤干细胞表达干细胞标记物CD133、nestin,分化后细胞表达星形胶质细胞的标志物GFAP、神经元的标志物MAP2;分选后CD133+细胞中miR-153的表达低于CD133-细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).转染后7 dNC组细胞一、二次成球数目均高于miR-153组,差异有统计学意义(P＜0.05); RT-PCR检测显示与NC组比较,miR-153组细胞CD133、nestin mRNA表达降低,GFAP、MAP2 mRNA表达升高,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫荧光染色与RT-PCR检测结果一致;转染后48、72、96 h miR-153组的细胞存活率均低于NC组,差异均有统计学意义;流式细胞仪检测显示miR-153组的细胞凋亡率(9.41％±1.98％)高于NC组(4.28％±0.31％),差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 上调miR-153可能成为新的针对胶质母细胞瘤干细胞的治疗策略.
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胶质母细胞瘤干细胞研究进展及其在胶质瘤治疗中的作用
胶质母细胞瘤是中枢神经系统肿瘤中常见的恶性肿瘤,患者生存期仅1年左右.胶质母细胞瘤干细胞(GSC)是早分离确认的实体瘤干细胞之一,在分子标记和生物学功能等方面与正常干细胞相似,具有自我更新、分化为多种细胞,以及少量细胞就可在免疫缺陷鼠成瘤的能力.GSC是肿瘤发生、发展、复发及转移的关键因素,具有易在体外长期培养并维持其遗传学、基因表达谱等特征,在肿瘤干细胞研究中具有重要示范意义.因此本文对GSC的研究进展及其在胶质瘤治疗中的作用等进行综述.
