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嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*的构建与鉴定
目的 构建携带FLAG-3NLS-FRB*融合基因的嵌合腺病毒,并检测其在AD-293细胞中的表达.方法 将FLAG标记的3段核定位信号(FLAG-3NLS)与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域(FRB*)基因通过重叠PCR技术拼接成FLAG-3NLS-FRB*,定向克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pAd5F35在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,感染AD-293细胞进行包装、扩增.采用基因转移单位(Gene transfer unit,GTU)法测定病毒滴度；RT-PCR及Western blot检测FLAG-3NLS-FRB*在AD-293细胞中的转录及表达.结果 腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FLAG-3NLS-FRB*经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确；FLAG-3NLS-FRB*正确克隆至腺病毒骨架质粒中；在AD-293细胞中包装、扩增获得了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,病毒滴度为2.0×1013 GTU/ml；嵌合腺病毒感染AD-293细胞后36 h,在细胞中可检测到FLAG-3NLS-FRB*基因的转录和蛋白的表达.结论 成功构建了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,并在AD-293细胞中成功表达了FLAG-3NLS-FRB*融合蛋白.
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嵌合腺病毒体外对人白血病细胞 U937的感染及生长抑制作用
目的研究嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP对人白血病细胞U937的感染及生长抑制作用。方法以空载体腺病毒Ad5GFP作为对照，将嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP感染人白血病细胞株U937，通过荧光倒置显微镜、流式细胞术和透射电镜分析病毒对U937细胞的感染性和复制活性；应用细胞计数试剂盒（CCK-8）分析细胞的增殖反映该病毒对细胞的杀伤作用；通过AnnexinV-APC/7-AAD双染流式细胞术分析早期细胞凋亡率，并采用免疫印迹法检测凋亡相关蛋白多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP ）的裂解。结果嵌合腺病毒Ad5f11pT PEGFP能感染人白血病细胞株U937，并能在其中复制产生大量子代病毒；该嵌合腺病毒对 U937细胞株的感染效率、生长抑制率均高于空载体腺病毒 Ad5GFP ，差异有统计学意义（P ＜0．05）；嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP诱导U937细胞发生凋亡的细胞比例较空载体腺病毒 Ad5GFP高，差异有统计学意义（P ＜0．05），并且检测到随时间逐渐增加的PARP裂解蛋白。结论嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP可有效感染人白血病细胞株U 937，并能在其中复制，能显著抑制人白血病细胞株U 937生长并诱导其凋亡。
