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瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定
目的 构建瓣状内切核酸酶1 (Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定.方法 提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定.将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达.结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确；在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍.结论 已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1.
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细胞凋亡清除障碍及瓣状内切核酸酶1基因变异在狼疮性肾炎发病机制中的作用
目的:探讨细胞凋亡清除障碍及瓣状内切核酸酶1(Fen1)基因变异在狼疮性肾炎(LN)发病机制中的作用. 方法:首先收集30例LN患者肾穿刺组织,用TUNEL法检测细胞凋亡,探讨LN病理分型、系统性红斑狼疮(SLE)活动度评分2000(SLEDAI 2000)与肾脏组织细胞凋亡指数(AI)的关系；其次,收集50例LN患者,25例健康者,20例胃癌患者的外周血标本,采用全血基因组DNA柱式试剂盒提取DNA,筑巢PCR扩增Fen1基因61563142 ～ 61563342目的片段,扩增后对目的基因进行测序,并将测序结果与基因数据库中人Fen1基因进行比较,计算突变位点频率,比较LN患者、胃癌患者、健康者Fen1基因突变情况. 结果:(1)所有患者肾组织凋亡检测均为阳性,凋亡细胞在肾小球及肾小管均呈散在分布,SLEDAI与其AI呈正相关(r=0.39,P＜0.05).根据ISN/RPS 2003制定的病理分型标准,30例LN患者中,病理类型以Ⅳ型多(40.00％),其次为Ⅱ型(26.67％),Ⅲ型16.67％,Ⅴ型13.33％,Ⅵ型3.33％,无Ⅰ型病变患者.(2)三组Fen1基因61563142 ～ 61563342目的片段未发现有统计学意义的碱基变异. 结论:LN患者存在细胞凋亡清除障碍,凋亡细胞的数量越多,SLE病情越活跃；LN患者Fen1基因61563142 ～61563342目的片段中未发现碱基变异,尚需要扩大样本量,或进行该基因的全基因组关联研究进一步证实Fen1基因在LN中的作用.
