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Cas9拆分质粒文献资料
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Cas9蛋白的真核拆分质粒构建及功能验证
目的 研究Cas9蛋白结构与功能的关系,拆分蛋白是否互补具有完整的特异性切割功能,进一步为微小Cas9的蛋白转导、腺相关病毒载体构建奠定基础 方法 对S.pyogenes Cas9进行改造,在第715 Gly和716 Gln之间断开,构建了Cas9-1 (1-715aa)和Cas9-2(716-1368aa)两部分拆分质粒,与HBB基冈的sgRNA转染293T细胞,研究拆分后的蛋白是否具有切割活性 结果 高分辨率溶解曲线(HRM high resolution melting)结果证明,Cas9拆分蛋白可以在体内切割DNA,Tm值与对照组相差约0.5℃;T7E1突变检测证明,同时转染两部分Cas9拆分蛋白质粒和sgRNA质粒时具有完整Cas9的切割作用,将拆分Gas9-部分与sgRNA共表达后,效率为完整Cas9蛋白的50％.
