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一个非综合征手足裂畸形家系的临床调查及遗传学分析
目的 分析一先天性手足裂伴并指／趾畸形家系的临床表现,并从分子水平查找致病原因,为罹患家庭提供遗传咨询.方法 通过X线检查资料及手足裂外观照片,对家系3代现存3例患者(共4例患者)进行临床分析,对3例患者用常规方法制备外周血淋巴细胞染色体标本,进行G显带核型分析.从7名家系成员(包含3例患者)外周血样品中提取基因组DNA.针对p63基因全部15个外显子及WNT10b基因5个外显子进行引物设计合成、PCR扩增、回收纯化并测序.结果 家系中现存3名患者均表现为双手中央分裂,其中1例患者双足呈楔形裂开,2例患者右足均为第3、4趾并指,皮肤黏连;G显带核型分析未发现染色体畸变;p63基因未检测到突变,WNT10b基因的外显子5a中发现一个碱基突变c.1058C＞T.结论 通过家系内患者临床表型分析,可将该疾病类型确定为非综合征手足裂畸形,且临床症状逐代加重.测序结果提示p63基因和WNT10b基因关键区域内的点突变都不是引起该家系手足裂畸形的原因.
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人Wnt10b基因真核表达载体的构建及表达鉴定
目的:利用基因工程技术构建人Wnt10b基因的pEGFP-N1-Wnt10b真核表达载体,观察其在COS-7细胞中的表达.方法:以pUC19-Wnt10b为模板,PCR扩增人Wnt10b基因的cDNA编码区序列,扩增产物和pEGFP-N1载体双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pEGFP-N1-Wnt10b,酶切和测序鉴定该载体;Lipofectamine TM2000将该载体转染入COS-7中,Western blot和免疫细胞化学检测COS-7 Wnt10b蛋白表达.结果:PCR扩增出的人Wnt10b基因cDNA正确克隆到pEGFP-N1载体,成功构建了pEGFP-N1-Wnt10b;将其转染入COS-7,COS-7 Wnt10b蛋白表达明显增高.结论:成功构建了人pEGFP-N1-Wnt10b,这为进一步研究Wnt10b基因功能奠定了前期基础.
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腺病毒介导Wnt10b基因调控人BMSCs成骨成脂分化的体外实验研究
目的 体外实验研究腺病毒介导Wnt10b基因表达与抑制对人BMSCs (human BMSCs,hBMSCs)成骨成脂分化的调控. 方法 取健康成人髂骨骨髓分离培养hBMSCs,取第4代细胞并分为4组:A、B、C组分别加入Wnt10b基因表达腺病毒载体、Wnt10b基因沉默(Wnt 10b-shRNA)腺病毒载体和空病毒转染细胞,D组细胞不进行转染作为空白对照组.各组进行成骨、成脂和无诱导培养,通过ALP染色、茜素红染色和油红O染色检测Wnt10b对各组成骨成脂分化的影响,通过实时荧光定量PCR检测成骨和成脂相关基因表达,Western blot检测成骨和成脂相关蛋白表达,了解Wnt10b对hBMSCs成骨成脂转录和蛋白水平的影响. 结果 成骨诱导培养后ALP染色4组均呈阳性,A组呈强阳性,B组染色弱;茜素红染色A组出现大量片状融合褐色矿化结节,B组见少许点状褐色矿化结节,C、D组出现大量点状褐色矿化结节.成脂诱导培养后油红O染色B、C、D组呈强阳性表现,其中B组强;A组散在小团状着色区,数量较其他组明显减少.荧光定量PCR和Western blot结果示:A组成骨转录因子和蛋白表达高于B、C、D组,B组低于C、D组;而成脂转录因子和蛋白表达与成骨转录因子及蛋白表达情况相反. 结论 Wnt10b基因高表达促进hBMSCs向成骨分化,低表达则促进成脂分化.
