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单细胞显微捕获技术联合LV-PCR系统在法医学中的应用
目的 显微操作法联合应用安利快得LV-PCR系统,从而建立一套完整的单细胞DNA分型方法.方法 利用显微操作法捕获新鲜口腔上皮细胞,将捕获的细胞直接放置到安利快得玻片反应位点上,加蛋白酶K孵育,然后加入PCR反应混合物进行反应.结果 3个口腔上皮细胞16次均获得完整分型,一个口腔上皮细胞16次中有14次获得完整分型,2次发生部分位点缺失,将该方法应用于两例模拟案例,取得了满意效果.结论 联合运用单细胞显微捕获技术和LV-PCR系统对解决微量和混合检材问题具有重要意义.
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单细胞PCR用于HLA分型的研究
目的 探讨单细胞PCR用于妊娠前HLA诊断分型.方法 分别采用碱、蛋白酶和冻融裂解法制备单细胞DNA模板,然后采用多重PCR分别扩增HLA-A,HLA-B基因的第2、3外显子和第2内含子区域,HLA-DrB1基因的第2外显子区域.结果 酶裂解法可有效制备单细胞DNA模板,单细胞DNA扩增成功率95%,所设计引物可有效扩增HLA-A、B和DrB1序列,全部操作可在6 h内完成.结论 本研究建立的巢式多重PCR技术对单细胞HLA分型具有较高的扩增效率,操作时间短,可望应用于临床妊娠前诊断.
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登革热病毒(DENV)包膜蛋白特异性人源抗体筛选与鉴定
目的 建立自外周血快速筛选识别登革热病毒衣壳的人源抗体的方法,从病毒感染者外周血记忆B细胞中筛选出特异性抗体并进行性质分析.方法 通过流式细胞术分选得到外周血中登革热病毒包膜蛋白特异性的单个记忆B细胞,结合高效单细胞PCR技术获得抗体基因序列,对重组表达的单克隆抗体进行结合活性及中和活性检测.结果 成功筛选到识别DENV-1包膜蛋白的6株人源单克隆抗体,其中4株抗体均具有很强的结合活性以及中和活性.结论 成功的通过流式细胞术对DENV特异性记忆B细胞进行分选,并结合单细胞PCR技术,实现了对DENV特异性人源单克隆抗体的高效筛选.通过该平台有希望筛选得到DENV的广谱中和抗体,用于登革热的预防和治疗.
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运用单细胞三重PCR对杜氏肌营养不良进行植入前遗传学诊断
目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的可行性.方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因.结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0.结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用.
