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MicroRNA-29b过表达慢病毒载体的构建及其生物学特性的研究
目的:构建针对小鼠microRNA-29b过表达的慢病毒载体,研究其在小鼠神经元GT1-7细胞系中的生物学特性.方法:化学合成两条寡聚核苷酸单链,通过搭桥互补延伸成DNA双链,形成miR-29b的前体结构,将酶切后的慢病毒载体FUGW通过同源重组的方法与miR-29b的前体结构进行连接,构建相应microRNA-29b过表达慢病毒载体,并包装成病毒颗粒后转染小鼠神经元细胞系GT1-7,通过博来霉素药物筛选获得稳转株,RT-PCR检测相关基因在mRNA转录水平上表达量情况.结果:测序图谱证实重组慢病毒表达质粒fF-miR-29b构建成功,GT1-7细胞稳转株中,miR-29b的表达量与对照组相比提高了约28倍,其靶基因DCX,Vdac1,Pten的表达量有所抑制,性发育相关基因LH-β,kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,GnRH,leptin-R没有明显变化.结论:利用慢病毒筛选的方法,成功在小鼠神经元GT1-7细胞中获得microRNA-29b过表达稳转株,为以后microRNA-29b的生物学特性的研究奠定了基础.
关键词： microRNA-29b 慢病毒颗粒 GT1-7细胞 靶基因 性发育相关基因 -
STAT6-ORF表达载体的构建与鉴定
目的 本文旨在构建STAT6-ORF表达载体,包装成慢病毒颗粒.方法 应用嵌套PCR法从生长状态良好的293FT细胞的cDNA中扩增STAT6的完整读码框片段(2544 bp),根据需要在引物的5'端分别引入Cla Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位点,将PCR产物克隆到pMD20T载体上,得到pMD20T-STAT6-ORF克隆;测序验证后,用Cla Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切pMD20T-STAT6克隆,回收酶切产物得到的STAT6-ORF片段,通过T4 DNA连接酶连接到pLVTHm表达载体上,经双酶切和测序验证正确,获得pLVTHm-STAT6-ORF表达载体.结果 构建带有增强绿色荧光蛋白EGFP(enhanced green fluorescence protein)标记的STAT6-ORF表达载体,包装成慢病毒颗粒,结果表明成功构建及包装带STAT6-ORF目的片段的慢病毒表达载体.结论 pLVTHm-STAT6过表达载体构建成功,可以进行慢病毒包装与鉴定.
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携带hFGF21基因慢病毒的制备及鉴定
目的 包装人成纤维细胞生长因子21(hFGF21)慢病毒颗粒、确定包装细胞人胚肾293T(HEK293T)细胞的形态特征以及对目的基因的转导能力.方法 对慢病毒重组质粒Lv105-hFGF21进行测序鉴定,在HEK293T细胞中包装为慢病毒颗粒并浓缩,经反转录PCR(RT-PCR)和电镜检测鉴定后,利用实时定量PCR测定病毒滴度.然后感染Vero细胞,经RT-PCR检测hFGF21 mRNA的表达、免疫荧光检测hFGF21蛋白的表达.结果 RT-PCR结果表明重组慢病毒能转录hFGF21 mRNA,电镜检测结果可以看到典型的慢病毒颗粒形态特征,其直径在40 ～70 nm;重组病毒原液的滴度是3.68×108 VG/mL、浓缩液的滴度是1.25×109 VG/mL；重组慢病毒感染Vero细胞后经RT-PCR检测到细胞中有hFGF21 mRNA表达,免疫荧光测到Veto细胞中有hFGF21蛋白表达.结论 成功包装了hFGF21慢病毒颗粒并在靶细胞中获得表达.
关键词： 人成纤维细胞生长因子-21 慢病毒颗粒 细胞 表达
