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神经粘附分子NCAM140基因RNA干扰质粒的构建与鉴定
目的:构建有效的小鼠神经粘附分子(NCAM140)基因的RNA干扰(RNAi)质粒载体,为研究NCAM140参与的细胞信号通路转导、其生物学作用以及以NCAM140为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒.方法:使用基因序列软件设计、筛选符合公开文献筛选参数的4条靶序列以及1条阴性对照序列,由上海吉玛技术有限公司合成.与载体质粒pGPU6/GFP/Neo重组后,分别命名为pSi-nca1、pSi-nca2、pSi-nca3、pSi-nca4和pSi-control.转染大肠杆菌感受态细胞.选择阳性克隆进行DNA测序鉴定,Western blot方法进行干扰靶点的筛选.选取干扰效率高的质粒转染MN9D细胞,普通光学显微镜分别计数同一视野细胞总数及GFP阳性细胞数,计算转染效率.结果:酶切和DNA测序结果证实shRNA正确插入pGPU6/GFP/Neo质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较,pSi-nca4组细胞NCAM140表达明显下调,细胞转染效率为62％.结论:成功构建靶向小鼠NCAM 140基因的RNAi质粒,为NCAM140参与的细胞信号通路的研究以及以NCAM140为靶点的基因治疗提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为研究其生物学作用奠定了分子生物学基础.
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脂筏在GDNF与其受体相互作用中的意义
目的:探讨脂筏对于GDNF与其膜受体相互作用的影响.方法:MN9D细胞和SD大鼠随机分成三组:GDNF组、PBS组、空白对照组.两种方式处理三组样品:破坏和不破坏细胞膜上的脂筏.通过免疫共沉淀和免疫印迹检测破坏脂筏前后GDNF及其配体结合受体GFRα1与四种膜受体(RET,NCAM140,integrinβ1和N-cadherin)之间的结合情况.结果:细胞膜上的脂筏未被破坏前,四种膜受体都能够与GDNF结合发生免疫共沉淀.脂筏被破坏后,GDNF只能与RET和N-cadherin结合发生免疫共沉淀,并且这种结合在GDNF组中多;而GFRα1只能和RET结合发生免疫共沉淀.结论:膜受体介导的GDNF生物学作用均可发生在脂筏这一平台上,脂筏在GDNF与其受体相互作用中扮演着重要角色.
关键词： 脂筏 GDNF 膜蛋白 RET NCAM140 Integrinβ1 N-cadherin
