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小鼠Dppa2基因shRNA载体的构建及干扰效果的检测
目的:构建有效的针时小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体.方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证.进一步将各干扰栽体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率.结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA栽体构建成功.将空载体及各重组栽体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调.结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础.
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RNA干扰抑制STAT6基因表达的初步研究
目的:构建针对信号转导子和转录激活子6(Singnal transducers and activators of transcription 6,STAT6)基因的干扰质粒,并观察其对STAT6蛋白表达的抑制效果.方法:将构建的短发夹干扰质粒(Short hairpin RNA,shRNA)表达载体,与合成的pIRES2-EGFP-STAT6基因表达质粒共同转染COS7细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Western blot观察蛋白表达的变化.结果:将pIRES2-EGFP-STAT6重组载体转染COS7细胞后,结果显示STAT6蛋白可以在细胞中高水平表达;与阴性对照组相比,STAT6 shRNA-1干扰组和STAT6 shRNA-2干扰组STAT6蛋白表达水平分别是23.1%和9.6%.结论:成功构建并筛选到具有显著干扰效率的STAT6干扰质粒,为哮喘的基因治疗研究奠定了基础.
