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COX-2shRNA干扰载体的构建
目的：构建靶向COX-2基因的有效shRNA干扰载体并进行鉴定分析。方法：根据Genbank提供的COX-2 mRNA序列，使用Designer3．0（Genepharma）软件进行设计DNA oligo，构建并化学合成shRNA模板，用酶切和测序方法进行分析鉴定。结果：通过酶切和序列测定表明，成功构建了COX-2 shRNA表达载体。结论：构建的COX-2 shRNA干扰载体，为下一步转基因研究，探讨COX-2功能奠定基础。
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小鼠Dppa2基因shRNA载体的构建及干扰效果的检测
目的:构建有效的针时小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体.方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证.进一步将各干扰栽体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率.结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA栽体构建成功.将空载体及各重组栽体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调.结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础.
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MCHR1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建有效针对小鼠黑色素浓集激素受体1(melanin-concentrating hormone receptor 1,MCHR1)的shRNA(smallhairpin RNA)真核表达载体.方法 设计合成3条小鼠MCHR1基因的shRNA序列以及1条无同源性的shRNA序列作为阴性对照,与质粒重组构建sh-MCHR1干扰载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定;脂质体法转染小鼠3T3-L1细胞后观察MCHR1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 经菌液PCR及DNA测序鉴定表明各shRNA载体构建成功;转染3T3-L1细胞后,与空载体组相比,阴性对照组MCHR1 mRNA和蛋白的表达均无明显差异,但实验组3种干扰载体均能显著抑制MCHR1 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05),且3种载体的抑制程度有一定的差异,以sh-MCHR1-1载体沉默效果佳.结论 sh-MCHR1干扰载体构建成功,为进一步探究MCHR1与肥胖症之间的关系奠定了实验基础.
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大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应
目的 构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响.方法 设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染人293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组).RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况.结果 与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P＜0.01或P＜0.05).结论 成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体.其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加.
关键词： Neuritin基因 shRNA载体 慢病毒转染 雪旺细胞 凋亡 -
小鼠高迁移率族蛋白B1基因短发卡RNA的构建及干扰效果检测
目的 构建有效靶向小鼠高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)基因的短发卡RNA(shRNA)载体.方法 针对小鼠HMGB1序列设计4条HMGB1干扰序列的shRNA载体:pYr-1.1-musHMGB1-sh1～4以及与哺乳动物基因组无同源性序列的shRNA作为对照(NC)组,Xho Ⅰ酶切鉴定其序列.然后利用质粒转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测干扰效率.结果 经酶切凝胶电泳证实shRNA构建正确;质粒筛选结果表明,转染48h后,pYr-1.1-musHMGB1-sh1～4及NC组的荧光表达率为85％、78％、75％、70％、60％;FQ-PCR显示pYr-1.1-musHMGB1-sh1～4组及NC组转染Hepal-6细胞48h后相对表达量分别为0.52±0.05、0.59±0.08、0.61±0.08、0.57±0.21、1.02±0.21.结论 成功构建表达靶向HMGB1的4条shRNA重组质粒载体,其中pYr-1.1-musHMGB1-sh1质粒对HMGB1基因的抑制作用强,为研究HMGB1的功能提供实验基础.
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人FoxA1 shRNA载体构建与检测
目的 构建有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,并验证其干扰效果.方法 设计合成3对针对人FoxA1基因的和1对无同源性的shRNA片段,将合成的shRNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,经过酶切和测序验证,成功构建人FoxA1基因的shRNA和空白对照载体.将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901),Realtime RT-PCR和Western-blotting检测干扰载体的干扰效率.结果 ①酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功.将空载体及各干扰载体分别转染人正常胃黏膜细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901)发现,和空白对照组相比,3组干扰载体能够从mRNA和蛋白表达水平明显抑制FoxA1的表达,但是3组质粒的抑制效率有一定的差异,以3号质粒对Foxa1的干扰效率强.结论 成功构建了三个有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,三组质粒都能有效地抑制FoxA1在GES-1细胞和SGC-7901细胞中的表达.
