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短发夹状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇敏感性的研究
RNA干扰(RNAi)技术是运用双链RNA引发的转录后水平基因沉默机制[1],特异性抑制靶基因转录,进而下调相应蛋白表达水平及功能.新近的RNAi技术,是利用DNA载体直接在体内表达短发夹状RNA(shRNA),特异性封闭相应的靶基因mRNA,抑制mRNA的翻译.与早期的RNA干扰技术相比,该方法的特异性和干扰效率均有较大提高,已广泛应用于多种研究领域.利用RANi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在沉默或休眠状态,从而使肿瘤细胞增殖速度减慢,凋亡加快,显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性.
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细丝蛋白A shRNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的检测
目的 构建细丝蛋白A(filaminA,FLNa)shRNA慢病毒载体,并检测其在肝癌细胞HepG2和Huh7中的干扰效率.方法 通过合成干扰基因片段,插入至shRNA慢病毒载体GV298中,构建FLNa shRNA慢病毒载体shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2,转染HepG2和Huh7细胞,荧光显微镜下观察红色荧光表达,Western blot法检测Filamin A干扰效率.结果 构建的FLNashRNA慢病毒载体经测序证明构建正确;转染24 h后,HepG2和Huh7细胞可见红色荧光;转染48 h后,shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2的干扰效率在HepG2细胞中分别约为45.4％和63.7％,在Huh7细胞中分别约为76.5％和78.3％.结论 成功构建FLNa shRNA慢病毒载体,在HepG2和Huh7细胞中干扰效率较高;可与多种病毒的受体蛋白相互作用,从而参与病毒的复制周期,为今后病毒复制及其致病机理的研究提供了新的思路.
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siRNA抑制鼻咽癌细胞CXCL8基因表达的研究
研究siRNA下调鼻咽癌CXCL8基因表达后对其肿瘤细胞生物学特性的影响.通过化学合成siRNA序列,并转染至鼻咽癌细胞CNE,用qPCR方法检测其干扰效果.在用ELISA方法确认蛋白下调后,通过CCK-8实验进一步研究细胞增殖能力的改变.数据显示,siRNA-2转染组可有效下调CXCL8基因的表达,mRNA干扰效果为(71±2)％,CXCL8下调至(25.3±3.1)pg/mL,同时细胞增殖能力明显下降.
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人FoxA1 shRNA载体构建与检测
目的 构建有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,并验证其干扰效果.方法 设计合成3对针对人FoxA1基因的和1对无同源性的shRNA片段,将合成的shRNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,经过酶切和测序验证,成功构建人FoxA1基因的shRNA和空白对照载体.将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901),Realtime RT-PCR和Western-blotting检测干扰载体的干扰效率.结果 ①酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功.将空载体及各干扰载体分别转染人正常胃黏膜细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901)发现,和空白对照组相比,3组干扰载体能够从mRNA和蛋白表达水平明显抑制FoxA1的表达,但是3组质粒的抑制效率有一定的差异,以3号质粒对Foxa1的干扰效率强.结论 成功构建了三个有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,三组质粒都能有效地抑制FoxA1在GES-1细胞和SGC-7901细胞中的表达.
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沉默Sam68基因抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖
目的：探讨Sam68对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖的影响。方法：针对Sam68 mRNA的第531～552靶位点，构建pLKO－Tet－On载体，制备慢病毒并感染、筛选Jurkat细胞，诱导干扰载体表达；采用real－time PCR和Western blot技术验证干扰效率；用体外细胞集落形成实验观察干扰Sam68基因表达后对细胞集落形成能力的影响；用流式细胞术检测分析Jurkat细胞细胞周期的变化。结果：Sam68基因表达下调能抑制了细胞的增殖和集落形成能力，导致S期细胞比例显著增加，G2期细胞比例显著降低，G1期细胞比例无明显差异。结论：shRNA靶向干扰Sam68基因的表达能有效抑制急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞的增殖。
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下调Sam68基因表达促进急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡
目的：探讨Sam68蛋白对白血病细胞Jurkat凋亡的影响。方法：针对Sam68靶点构建pLKO－Tet－On条件性真核表达干扰载体，制备慢病毒并感染Jurkat细胞，诱导干扰载体表达，筛选稳定表达shRNA细胞；采用实时荧光定量和免疫印迹技术检测干扰效率；应用流式细胞术检测细胞凋亡，采用免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白表达水平变化情况。结果：Sam68基因表达下调的细胞凋亡数量增多，伴随caspase－3活化水平增加和PARP活化水平下降，Akt磷酸化水平下降，Erk和Bcl－xL表达水平无明显变化。结论：Sam68基因表达下调可通过影响Akt信号通路影响caspase－3和PARP蛋白表达，从而促进Jurkat细胞凋亡。
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实时荧光定量PCR筛选有效RNA干扰方法的建立
目的 建立一种利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-QPCR)技术检测RNA干扰(RNAi)效果的方法,为筛选有效的RNAi提供一种科学、可靠的实验方法.方法 选用质粒载体pavu6.1-27构建的3个携带NCOA-3基因干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒,转染ECA109细胞,培养48 h,在荧光显微镜下观察荧光细胞的数目,计算转染效率,然后收集细胞提取总RNA,RT-QPCR检测各组转染细胞NCOA-3基因mRNA表达量,从而计算各组的干扰效率.结果 相对于A组未转染细胞,各组mRNA表达量分别为B组101.3%,C组85.5%,D组69.8%,E组72.2%,C、D、E组于A组和B组差异均有统计学意义(P＜0.05),而A组和B组相比差异无统计学意义(P＞0.05),计算得到3个干扰载体的干扰效率分别为39.0%、82.1%、75.6%.结论 RT-QPCR能进行RNAi效果的筛选,其自动化程度和检测灵敏度高;本研究建立的利用RT-QPCR筛选有效RNAi片段的方法可以为肿瘤研究、药物筛选、功能基因组研究等各个领域提供可靠的实验基础.
关键词： 实时荧光定量聚合酶链反应 RNA干扰 NCOA-3基因 转染效率 干扰效率 -
细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率的比较
目的 比较细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率.方法 采用胃泌素特异干扰载体转染人胃癌原代细胞株L25,经G418抗性筛选获得混克隆和单克隆细胞,应用RT-PCR、Western blot和免疫荧光三种方法对混克隆细胞和单克隆细胞干扰胃泌素基因的效率进行比较.结果 RT-PCR结果显示混克隆细胞胃泌素mRNA表达水平被明显抑制.在挑取的10株单克隆细胞中,胃泌素的表达均受到干扰,其效果有差异,其中有2株单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10胃泌素mRNA表达水平抑制率达到86％,抑制效率与混克隆细胞相同,其他8株单克隆细胞的平均抑制率为31％.Western blot和免疫荧光结果均显示单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10与混克隆细胞在胃泌素蛋白水平的干扰效果相同.结论 采用混克隆细胞进行生物学特性鉴定和后续基因表达水平研究,实验信息量大、周期短、污染几率小、可重复性强,是一种省时、简便、高效的方法.
