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NCTC11637外膜蛋白36ku基因的克隆及序列分析
目的:对人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H. pylori)36ku(OMP36)外膜蛋白进行基因克隆表达,探索研制H.pylori疫苗的新途径.方法:培养H. pylori菌株NCTC11637,采用酚:氯仿抽提和纯化基因组DNA.设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片断.将目的基因和PET32a(+)同时经Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ双酶切,纯化,连接后,转化含有目的基因的重组载体,酶切鉴定后进行序列分析.结果:经酶切,测序分析表明,插入的基因片断为987bp,与GenBank公布的H.pylori 26695、ATCC43504及J99序列相比较,同源性高达94%-96%,推测的氨基酸序列同源性为97%-99%,GenBank登录号059968.结论:成功克隆了H.pylori36ku的外膜蛋白的编码基因,其表达产物OMP36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了基础.
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幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定
目的 对人幽门螺杆菌(H.pylori)编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定,探索研制H.pylori疫苗的新途径.方法 培养和收集H.pylori标准菌株NTTC11637及临床菌株,采用酚∶氯仿抽提、纯化基因组DNA.设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增omp47基因片断.将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后,转化至E.coli DH5α及BL21,碱裂解提取质粒经BamHI和XhoI双酶切鉴定并进行序列分析.重组蛋白采用IPTG诱导表达后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性.结果 经酶切、测序分析表明,插入的基因片断为1 284bp,编码427个氨基酸.与GenBank公布的H.pylori标准株26695、43504及J99序列比对,核苷酸同源性高达94%～96%,编码氨基酸同源性96%～99%.经SDS-PAGE检测,电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带.Western blot检测表明重组蛋白有较好的抗原性. 结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础.
