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能量代谢基因表达改变在大鼠卒中发病学中的意义
目的探讨能量代谢基因表达改变在卒中发病学中的意义.方法应用冷刺激加高盐饮食复合环境因素作用于Wistar大鼠,诱发大鼠高血压脑卒中作为模型,应用抑制性差减克隆技术对卒中样发作鼠和正常对照鼠脑的差异基因进行筛选.经过两轮杂交后,产生的克隆均为脑卒中鼠脑组织特异表达的序列.每组随机挑取288个克隆,进行测序及GenBankBlast生物信息分析.结果两组共有456个可用序列,我们对每个与已知基因高度同源的序列以功能为参照进行了分类,发现大鼠卒中后脑组织能量代谢基因出现的频数高达26.5%,51个克隆与能量/三羧酸循环基因高度同源(P＜0.01),能量/三羧酸循环基因表达明显上调.结论能量代谢基因表达发生改变,可能造成脑卒中的敏感性增加.
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卒中大鼠脑组织抑制性差减文库的构建
目的:建立抑制性差减文库为获得差异表达基因提供方法.方法:提取正常组及卒中发作组大鼠全脑组织总RNA,分离出mRNA.两组mRNA反转录合成cDMA.实验组称为tester,对照组称为driver.限制性内切酶RsaI消化产生平端.将tester cDNA分成两份,分别连接不同的接头(Adaptor),driver cDNA不连接接头.tester cDNA连接好接头以后,再和driver进行两轮杂交.第一次PCR时仅有连接不同接头的双链cDNA分子可以呈指数扩增.然后采用巢式引物进行第二次PCR,进一步减少PCR产物的背景,强化差异表达序列.结果:总RMA经甲醛变性凝胶电泳紫外光下可见28S、18S条带清晰,28S:18S比值约为1.5:1,未见降解.双链cDMA经RsaI消化,cDNA片段变小.已经扣除的cDMA,GAPDH晚5个～15个循环出现条带,说明差减文库得到了有效扣除.结论:建立大鼠卒中发作及正常大鼠脑组织两个抑制性差减文库,为我们下一步研究卒中相关基因提供了方便.
