您当前的位置：
首页 > 文献资料
所属专业：
TU M2-PK文献资料
-
肿瘤型丙酮酸激酶的原核表达及单克隆抗体的制备
目的 利用原核表达系统表达重组肿瘤型丙酮酸激酶(TU M2-PK),并制备TU M2-PK的单克隆抗体(mAb).方法 提取卵巢癌细胞株SKOV3的RNA,通过逆转录、PCR扩增TU M2-PK基因,将其分别与带有His标签的pET-32a及GST标签PGEX-4T-1载体连接,转化DH5α菌进行基因克隆并测序鉴定.进一步构建表达体系,用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,终在BL21菌中表达TU M2-PK融合蛋白(分别含有His、GST-Tag),并进行SDS-PAGE及Western blot鉴定.获得的蛋白经纯化后作为免疫原及检测原,进行杂交瘤细胞的筛选.采用间接ELISA法测小鼠血清及细胞上清TU M2-PK抗体效价,Western blot分析mAb特异性.结果 成功构建pET-32a-TU M2-PK、pGEX-4t-1-TU M2-PK工程质粒,获得两种标签的融合蛋白.将重组蛋白纯化后作为免疫原免疫小鼠,筛选获得两株稳定分泌TUM2-PK抗体的杂交瘤细胞株.分别命名为6A11、7C11,Western blot实验显示,两株均可以与重组蛋白特异性结合,并且能识别子宫颈癌细胞株(Hela)、胃腺癌细胞(SGC-7901)、肝癌细胞(HepG2)中的天然蛋白.结论 成功制备了TU M2-PK蛋白及其单克隆抗体,为进一步开发TU M2-PK诊断试剂打下基础.
