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四环素诱导的丙型肝炎病毒非结构蛋白5B稳定细胞株的构建和检测
丙型肝炎病毒(HCV)感染个体后在宿主细胞内长时间保持低水平复制,与慢性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌的发生密切相关.目前,HCV感染后肝细胞发生转化的具体机制还不清楚.非结构蛋白5B(NS5B)是HCV编码的非结构蛋白之一,具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RdRp),是病毒复制所需的关键酶.除参与病毒复制外,NS5B通过直接与宿主蛋白相互作用影响细胞的正常功能逐渐成为人们关注的焦点.为深入了解NS5B在病毒复制和致病过程中的作用,本研究在肝癌细胞系HepG2细胞中构建了可由四环素诱导(Tet-On)的NS5B稳定细胞株.结果显示,与对照组相比,加入四环素可成功诱导NS5B.加入不同浓度的四环素或经过不同的诱导时间,目的蛋白均能同时被标签抗体和抗NS5B抗体检测.免疫荧光法进一步证实NS5B存在于细胞质内.本研究所构建的NS5B稳定细胞株可用于诸多后续试验,为深入研究NS5B的功能提供了细胞模型.
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HCV NS5B蛋白对不同HCV基因型来源RNA模板复制活性的比较
目的 分析HCV NS5B蛋白以不同HCV型来源的负链3'末端RNA为模板的复制活性,为优化以NS5B为靶点的抗HCV药物模型提供理论依据.方法 利用原核表达系统表达HCV NS5B蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化,分别以体外转录的la(-)3'T RNA、1b(-)3'T RNA和2a(-)3'T RNA为模板进行体外RdRP反应,Northen blot检测RdRp产物.结果 当以2a(-)3p'T RNA为模板时,RdRp产物量高,约为以1a(-)3'T RNA为模板时的RdRp产物量的220%,当以ib(-)3'T RNA为模板时产物量低,约为1a(-)3'T RNA为模板时的RdRp产物量的60%.结论 HCV NS5B对不同基因型来源的RNA模板具有选择性.
关键词： 丙型肝炎病毒 依赖于RNA的RNA聚合酶 非结构蛋白5B
