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腺病毒载体:基因调控文献资料
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内皮型一氧化氮合酶重组腺病毒表达载体的构建及其在食管平滑肌细胞中的表达和调控
背景:一氧化氮(NO)是一种重要的抑制性神经递质,其合成障碍与多种胃肠道动力障碍性疾病的发生密切相关.目的:构建四环素调控的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)重组腺病毒表达载体,实现eNOS在食管平滑肌细胞(ESMC)中表达的精确调控.方法:可调控重组腺病毒表达载体的构建分为3个步骤:首先,将编码目的基因eNOS的全长cDNA定向克隆于穿梭质粒pTRE-Shuttle中,获得一个能被四环素或其类似物强力霉素调控的表达盒(Tet-responsive expression cassette);然后,将表达盒与腺病毒DNA(Adeno-XTM viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒Ad-eNOS;后,Ad-eNOS转染人胚肾293细胞后被包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒Adeno-X-TRE-eNOS.用Adeno-X-TRE-eNOS和调控病毒Adeno-X-Tet-off共感染体外培养的ESMC,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot评价eNOS在靶细胞中的表达以及强力霉素对表达强度的调控情况.结果:体外连接法成功构建了可调控重组腺病毒表达载体Adeno-X-TRE-eNOS,其与调控病毒共感染ESMC后,RT-PCR和Western blot出现阳性结果.加入不同浓度的强力霉素可以抑制eNOS基因的转录强度,其抑制作用呈剂量-效应关系,强力霉素浓度达到0.01μg/ml时可以完全关闭目的基因的表达.结论:采用体外连接法成功构建了可调控的eNOS重组腺病毒表达载体,并介导了eNOS在体外培养的ESMC中的表达和调控,为进一步利用eNOS进行基因治疗奠定了基础.
关键词： 一氧化氮合酶 腺病毒载体:基因调控 食管平滑肌细胞
