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华支睾吸虫ATP合酶b亚基的组织和亚细胞定位
目的 了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)的虫体组织定位,并以HeLa细胞为替代模型观察其亚细胞定位.方法 用CsATP-synt_B重组蛋白免疫SD大鼠,取其抗血清对华支睾吸虫成虫石蜡切片进行间接免疫荧光染色,观察CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫组织中的分布.根据生物信息学预测的CsATP-synt_B线粒体转运序列(MTS序列)和核定位序列(NLS序列)位置,设计4组引物[CsATP-synt_B全长序列,以及3个缺失突变体(MTS-缺失线粒体转运序列、NLS缺失核定位序列、MTS-NKS粒体-核定位双缺失)引物],扩增出全长基因和3个突变体基因,构建重组质粒pEGFP-Nl-CsATP-synt_B1-300、pEGFP-Nl-CsATP-svnt_B30-300、pEGFP-Nl-CsATP-synt_B(1-238)+(257-300)及pEGFP-Nl-CsATP-synt_B(30-238)+(257-300).将这些重组质粒用阳离子脂质体转染HeLa细胞,48 h后用激光共聚焦显微镜观察CsATP-synt_B全长基因和3个突变体在HeLa细胞的表达和亚细胞定位.结果 CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫中分布较为广泛,主要分布在腹吸盘、卵巢、卵黄腺和皮层.绿色荧光蛋白GFP表明CsATP-synt_B全长序列表达于线粒体或细胞核,线粒体转运序列缺失突变体表达于细胞核,核定位序列缺失突变体表达于线粒体.双缺失突变体仅表达于胞浆.结论 CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫的分布与线粒体的分布一致,主要集中在能量代谢较旺盛的组织部位.CsATP-synt_B蛋白既可进入线粒体,也可进入细胞核,理论预测的定位序列得到证实.
