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Der f6文献资料
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粉尘螨6类变应原(Der f6)的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定
目的 构建粉尘螨6类变应原(Dermatophagoides farinae,Der f6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析.方法 根据Der f6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli Top10),经PCR和酶切鉴定并测序.将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,经纯化后连接并转化至E.coli Top10.构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至E.coli BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白.结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6.SDS-PAGE结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(Mr)为31 000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带.该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性.结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6.
