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弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达
目的构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒,分析其表达状况.方法采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列,经克隆后,亚克隆至原核表达载体中,构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒,分析GRA8的表达;将各重组菌进行诱导,将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白,免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性.结果GRA8基因被正确插入原核表达质粒中,原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低,几乎无完整GRA8的表达,截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化.纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别.结论GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低,纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性.
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重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答
目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答.方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.结果 GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达
目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒.方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况.结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达.结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8.
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弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建
目的构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒.方法参照GRA8序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段,克隆至pMD18-T载体;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAX1,分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠,观察其诱导的抗体应答.结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段,各组阳性克隆的序列正确,并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAX1上,构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白;真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体.结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体,分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒.
