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标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究
目的建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应(PCR)系统.方法应用标签引物扩增技术、Primer Premier 5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR,检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较.结果新建立的标签引物套式/多重PCR,检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血,间日疟原虫5～10个虫/μl血.检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样(恶性疟24份和间日疟47份)的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%.结论通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统,适用于检测现场采集的滤纸血样,其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法,是很有潜力的疟疾诊断技术.
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套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性和稳定性初探
目的 提高标签引物-套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性与稳定性.方法 用滤纸法采集非疟疾发热病人血样30份及其他传染病(感冒,流感,伤寒,肝炎等)患者血样20份;抽取恶性疟和间日疟各1例患者血4ml,进行系列稀释制备不同疟原虫含量的感染血样;健康者血样作对照.用热裂解法制备DNA模板,用线粒体细胞色素氧化酶基因作为靶基因,应用相关软件和网络资源(Primer Premier 5.0,PUBMED,NCBI-BLAST和Mfold服务器)设计和优化标签引物-套式/多重PCR,并用于检测所采集制备的各种血样.结果 间日疟与恶性疟患者血系列稀释为含1 000、100、10和1个虫/μl后经标签引物-套式/多重PCR检测,恶性疟和间日疟患者各稀释含虫血样分别在611 bp和255 bp出现1条带,能检测到原虫密度均为1个虫/μl血;非疟疾发热病人血样30份及其他传染病患者血样均为阴性;健康者血样未出现扩增条带,每种血样反复测试3次以上均获得同样结果.结论 经优化的标签引物-套式/多重PCR在疟疾诊断中具有较高的敏感性、特异性和稳定性.
