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PCR诊断牛新孢子虫病的初步应用
目的 以犬新孢子虫Nc-5基因为目的 基因的PCR诊断方法.检测奶牛流产的胎牛脑组织的新孢子虫.方法 根据GenBank发布的新孢子虫特异性基因片段Nc-5基因序列,设计1对特异性引物,以犬新孢子虫(Neosporacaninum)标准株DNA为模板,PCR扩增Nc-5基凶,与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌JM109,获得阳性重组质粒pMD18-T-Nc-5,并测序.以环形泰勒虫、牛巴贝斯虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫以及犬新孢子虫标准株DNA为模板进行扩增以验证PCR的特异性,采用紫外分光光度计测定犬新孢子虫标准株DNA浓度和纯度.取高纯度的DNA样品用灭菌水稀释,分别取不同量的DNA进行PCR扩增,确定PCR方法的敏感性;利用该方法对32份奶牛流产的胎牛脑组织样品进行检测,同时,对其中23份流产的母牛血样进行ELISA血清学检测(作为对照),以评价犬新孢子虫PCR方法的榆测效果.结果 克隆的犬新孢子虫标准株月的基因大小为350 bp,与GenBank(AY459289)中Nc-5基因序列一致性为98%,建立的犬新孢子虫PCR方法与环形泰勒虫、牛巴贝斯虫、刚地弓形虫和杜氏利什曼原虫均无交叉反应,低能检测犬新孢子虫DNA 3.125 pg,检测流产胎牛脑组织阳性率为18.8%(6/32).ELISA检验流产母牛血样抗体阳性率为17.4%(4/23),这4份阳性样品与其流产胎牛PCR检测结果均为阳性.结论 建立的犬新孢子虫PCR诊断方法用于检测奶牛流产的胎牛脑组织新孢子虫的感染效果较好.
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胎牛主动脉内皮细胞的培养
目的建立动脉内皮细胞(ECs)的体外研究模型.方法用消化法结合机械法的方法分离胎牛主动脉ECs,在pH7.0的M199培养液中培养.结果用Ⅷ因子相关抗原免疫荧光法以及倒置显微镜下细胞融合后呈单层生长、鹅卵石状排列,证实所培养的细胞为ECs.在无内皮细胞生长因子的条件下体外连续培养的细胞达18代.结论在人动脉取材极为不易的情况下,胎牛主动脉ECs的培养是很好的补充.
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第十八届国际器官移植学会罗马会议纪要
具有千禧纪念意义的第18届国际移植学会于2000年8月27日至9月1日在意大利古首都罗马召开。与会代表4 500人，分别来自65个国家和地区，是该学会成立34年以来规模大的一次盛会。会议对自Roy D. Owen发现异卵孪生双胞胎牛互为免疫耐受以来，半个多世纪的移植学进展进行了全面的总结。会议期间，梵帝冈现任教皇保罗二世首次圣临会场并发表演说支持和呼吁器官捐赠。会议期间6次主会场，42次分会场，分别口头报告论文485篇，壁展1 056篇。现将大会与未来发展方针有关的几个核心问题及进展分述如下： 一、Medawar器官移植大奖 应届Medawar奖分别授予Roy D. Owen和Robert S. Schwarz。现将两位得主的主要贡献分述如下： 1.Roy D. Owen: Owen教授为美籍动物学家，现年85岁。1953年发现异卵孪生双胞胎牛在胚胎期间共同一胎盘，在循环系统上互为联通，形成天然的血嵌合体。双胞胎牛在出生和成年后，如互相交换地进行皮肤移植，则不发生排斥。对于这种天然免疫耐受现象当时只知道与血液嵌合有关，并没有给出理想的机理上的解释。直到Medawar等通过小动物实验，证实这种免疫耐受属后天获得性，并指出这种获得性耐受可能与免疫系统成熟过程中接触对方血细胞带来的“移植物抗原”而导致针对该抗原谱的T细胞清除(Clonal Deletion)。因为当时Burent 关于抗体产生的克隆筛选（Clonal Seletion）学说已问世。两者在理论和证据上有相互支持的一面，因而确立了免疫学的“自我——非自我歧视”经典理论的基础。而支持这一理论的模式为克隆清除。支持这一模式的主要证据源于Owen教授的工作。因此，Medawar在与Burent分享诺贝尔奖后回信给Owen教授说：“在40余封贺信中，我愿意读到的就是你的，因为是您先开始了这项研究工作”。Medawar 40年前就对Owen教授的贡献作出了充分肯定，他荣获本届Medawar奖当之无愧。如果说P. Medawar是免疫耐受研究之父的话，那么Roy D. Owen就是当然的免疫耐受研究之祖了。 2.Robert S. Schwartz：美国Tufts大学医学院内科教授。新英格兰医学杂志副主编。他早展示化学制剂6MP能抑制小鼠免疫反应，延长移植物存活。该研究结果激发了Roy Calne从事免疫抑制治疗研究的浓厚兴趣。Roy Calne先用6MP展示了犬肾同种移植物的长期存活，而后又将CsA引入临床,使肾移植疗效成倍的提高。而6MP的衍生物硫唑嘌呤至今仍为临床移植的主要用药之一。它的化学合成者Hitchings和Elion也因此获诺贝尔化学奖。如果说Roy Calne是免疫抑制治疗之父的话，那么Robert S.Schwartz就是当然的免疫抑制治疗之祖了。 此次Medawar奖的选择是对免疫耐受和免疫抑制治疗的充分肯定，也预示这两个领域在现代移植学中仍占有重要地位。
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超高效液相色谱-质谱联用技术分析新生牛和胎牛血清组分
目的：探讨超高效液相色谱-质谱联用（UPLC/MS）技术对新生牛和胎牛血清组分中活性成分的分析和鉴别。方法采用UPLC/MS技术分析Gibco公司新生牛血清和Hyclone公司胎牛血清组分中的活性成分。结果特征图谱分析新发现：胎牛血清组分种类多于新生牛血清中组分，其质荷比（m/z）分别为498、273和448的物质。结论UPLC/MS技术可用于胎牛血清及新生牛血清的区分和鉴别，检测出胎牛血清中的几种成分可能是促进细胞发生增殖分化的主要活性物质。
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胎牛小肠上皮干细胞的分离和培养并诱导其向肝细胞样细胞分化
目的 建立胎牛小肠上皮干细胞(IESC)分离和培养的体系,并检测其表面标志物及向肝细胞样细胞分化的潜能.方法 取3～5月龄胎牛,分离小肠组织,用胶原酶消化获得IESC,在DMEM/F12培养基中培养,观察其形态学特征.传代培养、生长曲线分析其增殖能力,并探索体外分化潜能.反转录PCR检测IESC标志基因Bmi1、Hes1、Lgr5和细胞角蛋白19(CK19)的mRNA表达,免疫细胞化学染色检测CK19、Bmi1、LGR5蛋白的表达.经成纤维细胞生长因子4(FGF-4)和肝细胞生长因子(HGF)诱导后,通过糖原染色和反转录PCR法观察向肝细胞样细胞的分化情况.结果 IESC可在体外扩增培养,表达CK19、Bmi1、Hes1、Lgr5的mRNA和CK19、Bmi1、LGR5蛋白,诱导后细胞糖原染色阳性,表达甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的mRNA.结论 成功建立了IESC的分离培养方法,并成功诱导IESC向肝细胞样细胞分化.
