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一种用于白念珠菌基因敲除的新型载体的构建
目的 探讨对抗生素Zeocin耐药作为一种新的筛选标记用于白念珠菌基因敲除的可行性.方法药物敏感试验检测在不同pH值下Zeocin对白念珠菌的低抑菌浓度(MIC).PCR法扩增出Zeocin耐药基因--ZeoR,基因拼接方法构建出用于AAF1基因敲除的整合型载体pHS1-Zeo-HS2,并进行测序鉴定.氯化锂法将此整合型载体转化白念珠菌CAI4,对目的基因AAF1进行替换.Zeocin筛选出重组白念珠菌,提取重组菌基因组,用两组引物进行PCR扩增,进行遗传学鉴定.结果不同pH值下白念珠菌对Zeocin均敏感,并确定100 mg/L为筛选浓度.测序鉴定成功拼接出用于白念珠菌基因敲除的整合型载体.耐Zeocin重组白念珠菌使用PCR方法和测序鉴定,发现原AAF1基因已被ZeoR基因替代.结论成功构建可用于白念珠菌基因敲除的新型载体.
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Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建
目的 为研究重组痘苗病毒通用载体,构建融合Zeocin和GFP双筛选标记质粒pCB-ZeoGFP.方法 质粒LeGo-G/Zeo含有Zeo-GFP融合基因片段,通过PCR反应、BamHI酶切后连接替换空白质粒pCB的筛选基因gpt,通过菌落PCR,酶切图谱分析及测序分析鉴定重组质粒,构建成功后将其与野生型痘苗病毒进行位点特异性同源重组,经Zeocin药物筛选2代后,用流式细胞仪观察重组痘苗病毒GFP表达.结果 经菌落PCR,1号、5号和10号菌落中扩增出426 bp 的目的条带,与预期的大小完全一致,经酶切分析和DNA测序进一步验证了重组质粒pCB-Zeo-GFP;该质粒与野生型痘苗病毒同源重组,得到了重组的痘苗病毒；Zeocin 筛选2代后,病毒上清感染细胞,流式细胞分析7.18％的细胞中有CFP的表达,而阴性对照仅有1.43％；Zeocin 药物筛选5代后,通过激光共聚焦可在80％以上的细胞中观察带GFP;提取的重组痘苗基因组DNA也扩增出预期大小目的条带.结论 含Zeocin和GFP双筛选标记的新型重组痘苗病毒不仅具有可观察性且具有药物抗性,非常容易进行筛选鉴定.
