首页 > 文献资料
-
LCRG1基因5'端调控区域的克隆及活性测定
背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚, 本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列, 寻找与其表达有关的调控序列.方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～+585 bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中.与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性.结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ +585 bp)片段,测序正确; pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3 basic 的35倍.结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191 bp～ + 585 bp),该片段具有启动子活性.
-
miR-1264对喉癌Hep2细胞增殖和迁移的影响
目的 miR-1264在喉癌中表达下调.文中旨在研究miR-1264对喉癌Hep2细胞生物学功能的影响及是否参与下调LCRG1基因的表达. 方法 Real-time quantitative PCR检测miR-1264在人喉癌组织中的表达情况;将转染mimic/in-hibitor NC Hep2细胞设为对照组,将未转染Hep2细胞设为空白组,将转染miR-1264 mimic/inhibitor设为实验组.利用MTT、Transwell分别观察miR-1264对Hep2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;luciferase实验验证miR-1264和LCRG13′UTR的结合;RT-PCR、Western blot分别检测miR-1264、LCRG1蛋白表达. 结果 与对照组和空白组相比,Hep2细胞瞬转miR-1264 mimic后,活细胞数量明显增加,增殖能力显著增强(P<0.05);而瞬转miR-1264 inhibitor后,活细胞数量明显降低,增殖能力减弱(P<0.05).与对照组[(80.80±1.07)个]及空白组[(73.60 ±1.44)个]迁移细胞数量相比,实验组[(97.00 ±1.41)个]明显增加(P<0.05),迁移能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(80.00±1.11)个]及空白组[(73.60 ±1.44)个]迁移细胞数量相比, miR-1264 inhibitor组[(71.40±1.21)个]明显降低(P<0.05),迁移能力亦减弱(P<0.05).与对照组[(43.00±1.41)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(57.00±1.00)个]明显增加(P<0.05),侵袭能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(61.20±1.50)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(27.60±0.93)个]明显降低,侵袭能力受到显著抑制(P<0.05),利用 RT-PCR验证瞬转成功后,进一步应用 Western blot实验检测 LCRG1蛋白表达结果,显示:实验组LCRG1蛋白表达较 NC对照组和空白组均无明显差异(P>0.05). 结论 miR-1264在喉癌组织中高表达,miR-1264可能不参与LCRG1蛋白的表达下调,但能增强Hep2细胞的增殖、迁移和侵袭能力.
-
Sp1和Egr-1对LCRG1基因启动子转录活性的调节研究
目的:目前LCRG1基因转录调控机制不清,现拟研究Sp1和Egr-1对人LCRG1基因启动子的转录调节. 方法:利用MatInspector软件分析LCRG1基因启动子区域内潜在的转录因子结合位点,Sp1、wtEgr-1、mtEgr-1真核表达质粒与LCRG1启动子重组质粒的共转染实验,分析其对LCRG1启动子活性的影响. 结果:生物信息学提示LCRG1基因启动子区域存在Sp1和Egr-1等位点,外源性突变型转录因子Egr-1能上调LCRG1基因启动子的活性.结论:突变型转录因子Egr-1可能参与该基因的表达调控.
-
miR-181d靶向LCRG1调控喉癌细胞Hep2增殖与迁移的机制
目的 探讨miR-181d对LCRG1的调控作用及miR-181d对喉癌Hep2细胞增殖的影响.方法 利用基因芯片和RT-PCR技术检测miR-181d在喉癌组织和癌旁组织中的表达;生物信息学预测喉癌候选抑瘤基因LCRG1的靶标miRNAs;构建LCRG1 3'UTR荧光素酶载体,双荧光素酶检测系统测定其荧光素酶活性;将miR-181d mimic和miR-181d inhibitor瞬转入Hep2细胞,RT-PCR结果验证miR-181d的表达后,再用Western blot法检测各组中LCRG1蛋白的表达;采用MTT实验、迁移、侵袭及流式细胞术等实验,观察转染组与对照组细胞的增殖.结果 miR-181d在喉癌组织中的表达量较癌旁组织明显升高(P=0.046 5);miR-181d可能靶向结合LCRG1,且LCRG1蛋白表达与miR-181d表达呈负相关;下调miR-181d能降低Hep2细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并使细胞周期主要阻滞于G1期.结论 在Hep2细胞中miR-181d可以结合LCRG1 3'UTR,负性调控LCRG1的表达并使Hep2细胞增殖、迁移和侵袭能力增强.
