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携突变减毒Stx1编码序列重组腺病毒的构建及其抗乳腺癌的活性
目的:构建携带1/100、1/1 000减毒活性的突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1, Stx1) 编码序列的复制缺陷型腺病毒,并观察其抗人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的活性.方法:重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/100、1/1000的突变减毒Stx1编码序列,T-A克隆并测序后构建携带该编码序列的复制缺陷型腺病毒载体Adv-Stx-1R170L.制备人乳腺癌T47D细胞移植瘤裸鼠模型,Adv-Stx-1R170L肿瘤局部注射给药,评价其体内抑瘤能力.结果:经测序证实正确克隆了1/100、1/1 000减毒活性的突变减毒Stx1编码序列,成功构建携带该突变减毒Stx1编码序列的复制缺陷型腺病毒载体Adv-Stx-1R170L.体内实验显示,Adv-Stx-1R170L可以有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长,与携带绿色荧光蛋白编码序列的腺病毒对照组、PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:成功构建了携带1/1 000原毒素活性的突变减毒Stx1编码序列的重组复制缺陷型腺病毒载体,该病毒载体可以有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长,且未见明显毒性作用.
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突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的抗肿瘤血管活性
目的: 考察突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1, Stx1) 真核表达载体抗肿瘤血管的活性.方法: 使用流式细胞仪检测突变减毒Stx1真核表达载体转染对CHO细胞的影响;分别建立稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的CHO细胞株,使用这2个细胞株和对照细胞株的培养上清分别处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),观察其对HUVEC的增殖、迁移能力和形成管样结构能力的影响;使用人卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,观察突变减毒Stx1对肿瘤新生血管的作用.结果: 突变减毒Stx1真核表达载体转染的CHO细胞未出现明显的凋亡或坏死改变;获得稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的基因工程细胞株,这些细胞株的培养上清与正常CHO细胞培养上清相比,能够在体外实验中抑制HUVEC的生长(P＜0.05),且该作用可以被Stx1 B亚基抗体阻断;突变减毒Stx1能够抑制HUVEC的迁移能力和管样结构形成能力;体内实验显示1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1真核表达载体治疗组与空载体对照组或生理盐水对照组相比,肿瘤微血管密度明显下降(P＜0.01).结论 :成功建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株.证实突变减毒Stx1能够有效地抑制HUVEC的生长及正常功能的发挥.体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的血管生成.
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突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的构建及其抗卵巢癌的活性
目的: 构建表达突变减毒的志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1, Stx1) 的真核表达载体,并考察其抗人卵巢癌细胞SKOV3的活性.方法: 重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/10和1/100的突变减毒Stx1编码序列,T-A克隆并测序后分别连入真核表达载体pcDNA3.1.转染SKOV3细胞,RT-PCR法检测Stx1 mRNA在SKOV3细胞中的表达,观察突变减毒Stx1对SKOV3细胞周期的影响和致SKOV3细胞死亡的方式.使用SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,评价其体内抑瘤能力.结果: 突变减毒Stx1真核表达载体经酶切和测序鉴定与预期突变序列一致;RT-PCR证实转染后的SKOV3细胞中存在目的mRNA;体外实验观察到该载体转染可以使人卵巢癌SKOV3细胞的细胞周期阻滞于G2/M期,转染后SKOV3细胞死亡的主要途径是坏死;体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的生长.结论: 通过重叠PCR方法获得2种突变减毒Stx1编码序列,成功构建了相应的真核表达载体,并证实该载体具有明显的抗卵巢癌活性.
