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体外连接技术文献资料
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人骨形成蛋白-2基因腺病毒表达载体构建方法的优化
目的:探索采用体外连接技术替代同源重组方法构建Ad-BMP-2,优化腺病毒载体构建方法.方法:将BMP-2基因连接到辅助载体pShuttle2后,以限制性内切酶PI-Sce Ⅰ及Ⅰ-Ceu Ⅰ酶切,获得含启动子Pcmvie的BMP-2基因片段,然后将其连接到经同样双酶切的Adeno-X载体上,获得含BMP-2基因的重组腺病毒载体Ad-BMP-2.将其以限制性内切酶Pac Ⅰ酶切线性化后,转染HEK293细胞,包装重组腺病毒颗粒,并采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定.结果:重组载体pShuttle2-BMP-2及Adneo-BMP-2均采用酶法切及PCR鉴定,鉴定结果均与理论相符.将包装后的重组腺病毒以PCR鉴定,以1%琼脂糖电泳见1.2 kb及287 bP有带,与MBP-2及腺病毒扩增片段大小相符.结论:与传统的同源重组方法相比,体外连接技术方法简单、快捷,并且此方法不需噬斑纯化、筛选方法简便,提高了腺病毒载体构建的效率;同时,Ad-BMP-2的构建成功为后续进行BMP-2基因的治疗研究奠定了坚实的基础.
