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PD-L1基因3'UTR单核苷酸多态性与膀胱尿路上皮癌关系的病例对照研究
目的:探讨免疫关卡点分子程序性死亡配体1 (programmed death ligand 1,PD-L1)基因3'端非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)发病风险及临床病理特征之间的关系.方法:采用病例-对照研究方法,PCR-LDR技术分别检测2013年6月至2015年12月在青岛大学附属医院泌尿外科住院手术治疗的213例BUC患者和251例同期健康体检者PD-L1基因3'UTR的rs4143815位点和rs2297136位点基因型分布频率,采用卡方检验和非条件多因素Logistic回归分析不同基因型与BUC发病风险以及临床病理特征之间的关系.结果:BUC组PD-L1基因3'UTR的rs4143815位点基因型分布频率与对照组相比存在明显差异,GG基因型个体发生BUC的风险是CC基因型的2.83倍(95％CI:1.82～4.64,P＜0.01),携带G突变基因(CG/GG基因型)个体BUC发病风险是CC型基因个体的1.53倍(95％CI:1.01～2.24,P＜0.01),同时BUC组rs4143815位点携带G突变基因频率与BUC病理分级和临床分期具有相关性(P＜0.05或P＜0.01);而在rs2297136位点,BUC组和对照组基因型分布频率无显著差异,CC、CT及TT基因型个体之间发生BUC的风险亦无显著差异(均P＞0.05).结论:PD-L1基因3'UTR的rs4143815位点SNP与BUC的发病风险和恶性进展可能具有相关性.
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socs3基因3'端非翻译区野生型与突变型载体的构建及活性鉴定
目的 研究非编码小RNA-1896(miRNA-1896)和miRNA-409-3p对细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,socs3)基因的调控作用,构建socs3基因3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)野生型和突变型重组荧光素酶报告载体.方法 以原代培养的小鼠星形胶质细胞总cDNA为模板,通过点突变和缺失突变的方式分别对socs3 3'-UTR序列中miRNA-1896和miRNA-409-3p种子区的结合位点CAGAGA(897～902位)和AACATT(1425～1430位)进行突变,并将野生型的3'-UTR序列与突变的3'-UTR序列分别插入到虫荧光素酶表达质粒pGL3-Promoter获得重组质粒,命名为pGL3-SOCS3-WT、pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2.将上述重组质粒分别与miRNA-1896和miRNA-409-3p共转染至HEK293T细胞中,测定虫荧光素酶的活性.结果 酶切验证及测序结果表明,重组质粒pGL3-SOCS3-WT、pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2构建成功.与对照组相比,转染miRNA-1896和miRNA-409-3p均显著降低了pGL3-SOCS3-WT虫荧光素酶的活性,但对pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2荧光素酶的活性并无明显影响.结论 成功构建了socs3 3'-UTR野生型及突变型的虫荧光素酶重组表达质粒,确认CAGAGA(897 ～ 902位)和AACATT(1425～1430位)分别是miRNA-1896和miRNA-409-3p种子区与socs3 3'-UTR结合的关键位点.
关键词： 微RNA 细胞因子信号抑制蛋白-3 3'端非翻译区 虫荧光素酶报告载体 -
健康人和T-ALL患者BCL11 B-3'UTR miRNA结合位点区域的单核苷酸多态性/突变情况
目的:建立检测B细胞淋巴瘤/白血病11B基因3'端非翻译区(BCL11B-3'UTR)微小RNA(miR-NA)结合位点区域单核苷酸多态性(SNP)和突变的方法,并初步分析健康人和T细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者的SNP/突变情况.方法:通过TargetScan等生物学软件对GenBank数据库中BCL11B-3'UTR序列的miRNA结合位点进行预测分析;设计扩增包含主要BCL11B-3'UTR中miRNA结合位点区域的特异性引物,PCR扩增20例健康人和21例T-ALL患者外周血单个核细胞DNA的相应片段并送核苷酸序列分析后比对其序列变化情况.结果:根据context++score和seed match类型等评价标准筛选得到BCL11B-3'UTR中24个高度保守的潜在miRNA结合位点;发现1例T-ALL患者存在BCL11B-3'UTR第2402位点核苷酸替换(T>C),该突变已在dbSNP数据库登记(rs184678181);健康人BCL11B-3'UTR miRNA结合位点区域未检测到SNP/突变.结论:健康人和T-ALL患者BCL11B-3'UTR序列突变罕见.本研究率先发现1例T-ALL患者BCL11B-3'UTR的第2402位点存在T>C改变,涉及hsa-miR-6814-5p结合位点区域.该SNP对BCL11B表达调控的影响有待进一步研究,以期为BCL11B在T-ALL中的作用研究提供新的资料.
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小鼠MIA3基因3'-UTR区荧光素酶报告载体的构建及鉴定
目的 建立靶向miR-374b的MIA3 psicheck2野生型及突变型载体,为双荧光素酶报告实验提供前期保障. 方法 构建MIA3 psicheck2野生型及突变型载体,首先根据小鼠MIA3-3 'UTR序列信息设计其扩增引物,以小鼠血液全血基因组DNA为模板PCR扩增MIA3-3 'UTR序列,并将其克隆至psicheck2双荧光素酶报告载体中.然后,设计突变引物将miR-374b种子序列靶标TATTATA突变成AAATTAT构建突变载体.其次,采用载体酶切鉴定及测序法对构建的载体进行鉴定. 结果 琼脂糖电泳分析,载体PCR扩增大小与理论大小相符合.DNA测序鉴定MIA3-3 'UTR-WT载体构建成功.突变型载体的构建,成功将miR-374b种子序列靶标TATTATA突变成AAATTAT. 结论 载体的成功构建,为进一步鉴定miR-374b与成软骨分化相关靶基因MIA3是否真正具有结合位点奠定了基础.
关键词： 黑色素瘤活性抑制蛋白 微小RNA 3'端非翻译区 荧光素酶报告载体 软骨分化
