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G418抗性筛选文献资料
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Annexin32酵母分泌型表达载体的构建及其高拷贝转化子的快速筛选
Annexin家族是20世纪70年代末发现的一类钙依赖性磷脂结合蛋白,广泛存在于真核生物细胞内,迄今为止已发现31个annexin亚家族.
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人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选
目的 采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定.方法 从人外周血中提取总RNA.应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA.然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化人毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化.结果 获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株.经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31 000的蛋白区带.在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agaroso亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白.结论 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性.
关键词： 可溶性Ⅰ型补体受体1 毕赤酵母细胞 G418抗性筛选 分泌型表达载体
