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人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选
目的 采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定.方法 从人外周血中提取总RNA.应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA.然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化人毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化.结果 获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株.经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31 000的蛋白区带.在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agaroso亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白.结论 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性.
关键词： 可溶性Ⅰ型补体受体1 毕赤酵母细胞 G418抗性筛选 分泌型表达载体 -
用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1
目的 采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCRI),研究重组人sCRI融合蛋白的体外生物学活性.方法 从人外周血中提取总RNA.应用RT-PCR获得人sCRI全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确.电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中.将经G418抗性筛选出的重组sCRI酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果 获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1.经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株.经甲醇诱导含pPIC9k-sCRI的酵母SMD1168细胞表达出重组sCRI融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31 000的蛋白区带.在Westem Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCRI融合蛋白及较高的生物学活性.结论 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统巾的高水平表达.并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.
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重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定
目的 在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便.方法 从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆人真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pP1C9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+--NTA agarose亲和层析纯化.结果 经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量高.此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别.经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白.结论 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性.
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重组sCR1在毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定
目的:酵母细胞SMD 1168表达人sCRI,并对重组蛋白进行纯化.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCRI全长eDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCRI的重组质粒(pPIC9K-sCRI);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD 1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化.结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCRl的酵母细胞表达出重组人sCRI的融合蛋白,48～72 h sCR1融合蛋白表达量高.此蛋白在凝胶上表现为Mr大于31 KDa的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCRl的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCRI融合蛋白.结论:人sCRI融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性.
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磷脂转运蛋白在毕赤酵母中的高效表达
为深入了解磷脂转运蛋白的结构和功能,从中国人胎肝组织总RNA成功克隆了磷脂转运蛋白成熟肽基因,所得磷脂转运蛋白基因通过同源重组整合至毕赤酵母细胞染色体的醇氧化酶AOX1基因中,甲醇诱导后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示诱导表达蛋白分子量约75 kDa,薄层扫描显示表达蛋白占酵母蛋白总量的28%,为大量制备重组磷脂转运蛋白奠定了基础.
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重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性
目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2+ -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.
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重组人sCR1在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定
目的:酵母细胞SMD1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化.结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48～72 h sCR1融合蛋白表达量高.此蛋白在凝胶上表现为Mr约31 000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性.
