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NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究
目的 构建大鼠NELL2基因真核表达载体peDNA3.1(-)-NELL2的mieroRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应.方法 从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的 片段克隆至表达载体peDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2.针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4).将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组).采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染peDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组.结果 酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确.Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P＜0.05或P＜0.01).结论 成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒.证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应.
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不同性发育期雌性大鼠下丘脑组织NELL2和GnRH mRNA表达研究
目的 研究不同性发育期雌鼠下丘脑组织中NELL2和GnRH mRNA表达的变化.方法 SD雌鼠按日龄分为幼年组(20日龄)、青春期前组(30日龄)、青春早期组(35日龄)和性发育成熟期组(45日龄),每组10只.Real-time PCR检测各组雌鼠下丘脑组织NELL2、GnRH mRNA表达,并进行组间比较和分析.结果 在幼年组、青春期前组、青春早期组和性发育成熟期组雌鼠的下丘脑组织中,NELL2 mRNA相对表达分别为-1.01±0.09、-0.78±0.16、-1.09±0.10和-1.14±0.12;GnRH mRNA相对表达分别为-2.92±0.15、-2.44±0.10、-1.66±0.13和-2.13±0.19.统计学分析表明,NELL2 mRNA表达为青春期前组>幼年组>青春早期组>性发育成熟期组,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);GnRH mRNA表达为青春早期组>性发育成熟期组>青春期前组>幼年组,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 不同性发育期雌鼠下丘脑组织中NELL2和GnRH mRNA表达水平明显不同;与GnRH mRNA比较,NELL2 mRNA表达高峰出现较早.提示在青春期前,NELL2可能通过上调GnRH神经元GnRH mRNA表达而参与性发育启动.
