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广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定
目的 通过RT-PCR扩增巴马小型猪GGTA1基因,分析其序列的结构特点并构建真核表达载体,为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础.方法 根据NCBI上发布的猪α-1,3半乳糖转移酶基因cDNA序列(AF221508),设计合成一对含有 HindⅢ和BamHI酶切位点的特异性引物,以广西巴马小型猪肝脏组织总 RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;将目的基因与pEGFP-N 1进行双酶切后连接构建真核表达载体pEGFP-GGTA1,通过测序,双酶切鉴定.结果 所克隆的广西巴马小型猪GGTA1基因存在缺失第五外显子(81-116) 的GGTA1序列,序列全长1 080 bp和未缺失第五外显子的GGTA1序列,全序列为1 116 bp.构建两个表达载体(缺失第五外显子 pEGFP-GGTA1-1、未缺失第五外显子pEGFP-GGTA1-2).结论 广西巴马小型猪GGTA1基因存在第五外显子缺失的现象,通过对GGTA1基因克隆序列进行分析以及构建两个真核表达载体,为后面在猪源PK-15细胞中对其进行表达鉴定以及巴马小型猪 α-1,3半乳糖转移酶基因的沉默实验奠定基础.
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α-1,3半乳糖转移酶基因700C＞G点突变导致B型表型改变
目的:研究α-1,3半乳糖转移酶基因突变导致B型表型改变的血清学特点及分子机制.方法:分别使用单克隆标准血清、抗A1、抗H、多克隆人源抗A、人源抗B及ABO试剂红细胞、A2细胞、A2B细胞,进行血型血清学实验；采用PCR-RFLP方法进行基因分型,并扩增ABO基因第6和第7外显子进行克隆测序.结果:先证者αt-1,3半乳糖转移酶基因700C＞G点突变,基因型为B(A)700G/O,血型表型为AwB;其19名家系成员中,携带有该基因的成员共8名.结论:α-1,3半乳糖转移酶基因700C＞G点突变,可导致遗传学上为B型的人,其表型发生改变；临床上出现血型血清学实验不能确定的血型时,可采用分子生物学检测技术进行ABO血型分型,提高临床安全输血水平.
