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rhuPAa-melittin发酵条件及大规模纯化方法
目的 通过rhuPAa-melittin在80 L发酵罐中的发酵表达,优化发酵条件及改进适合大规模纯化的方法,获得纯化的目的蛋白.方法 采用实验制备的rhuPAa-melittin重组质粒,通过电转化法将rhuPAa-melittin-pPICZαC载体转入毕赤酵母(Pichia pastoris)中,用PCR法扩增和检测rhuPAa-melittin基因在毕赤酵母基因组中的整合.利用毕赤酵母进行小量发酵,摸索佳表达时间、pH及佳的纯化方法.通过rhuPAa-melittin在80 L发酵罐中的发酵表达,优化发酵条件及改进适合大规模纯化的方法.结果 rhuPAa-melittin发酵条件在温度为28℃～30℃,FM21培养基中添加0.5％的蛋白胨,甲醇终的流加速度控制在9 mL/(h.L),初始发酵液体积、DO值(溶解氧)在25％～ 30％,发酵时间为12h,pH在6.0～7.0时获得高产量、高纯度、高收率的蛋白.结论 获得产量约350 mg/L,纯度可达96％以上,收率可达65％左右的rhuPAa-melittin蛋白.
关键词： rhuPAa-melittin 发酵 纯化 -
rhuPAa-melittin 的生物活性检测
目的：利用高纯度的 rhuPAa-melittin 进行人成纤维细胞和卵巢癌细胞进行活性检测，探讨 rhuPAa-melittin 对卵巢癌治疗作用及对正常细胞毒性作用。方法利用高纯度的 rhuPAa-melittin 蛋白分别作用于人成纤维细胞和人卵巢癌细胞 SK-OV348 h，在490 nm 波长处测定其吸光度，以反映活细胞的数量并间接反映 rhuPAa-melittin 对培养中细胞的生长抑制作用。结果人卵巢癌细胞 SKOV3组，在4μg/mL 时对细胞抑制率已经达到了66．59％，在16μg/mL 时，细胞已经全部死亡，差异有统计学意义（P ＜0．05）。而人成纤维细胞组，在4μg/mL 时其对细胞的抑制率仅为达到7．3％，8μg/mL 时抑制率为12．3％，16μg/mL 时抑制率为22．0％。结论rhuPAa-melittin 对人卵巢癌细胞 SKOV3细胞有着明显的抑制杀伤作用，而对于人成纤维细胞的抑制作用不明显。
关键词： rhuPAa-melittin 成纤维细胞 卵巢癌细胞 -
rhuPAa-melittin在卵巢癌体内外的作用机制
目的 利用流式细胞术检测不同浓度的rhuPAa-melittin作用于卵巢癌细胞的活性,进而初步探讨rhuPAa-melittin对卵巢癌细胞的抑制作用及体内抗瘤作用.方法 利用不同浓度的rhuPAa-melittin蛋白分别作用于人卵巢癌细胞48 h,利用流式细胞术检测细胞周期及凋亡.rhuPAa-melittin蛋白作用于卵巢癌皮下移植瘤模型,观察移植瘤的生长情况.结果 分别以0、4、8、16μg/mL浓度作用人卵巢癌细胞48 h,凋亡率分别为1.16%、3.83%、6.51%、10.2%.不同浓度下G0/G1期细胞无明显作用,主要作用于S期,阻止由S期进入G2/M期,从而抑制肿瘤生长.结论 rhuPAa-melittin在卵巢癌的体内外实验中有效抑制了肿瘤的生长.
关键词： rhuPAa-melittin 卵巢癌细胞 流式细胞术 移植瘤
