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基于miRNA-30的RNAi表达框架的构建及其有效性验证
目的 构建基于人源性miRNA-30,针对EGFP基因的RNAi表达框架并验证其有效性.方法 融合PCR构建RNAi表达框架,经凝胶电泳、测序比对及二级结构预测后,将该表达框架与pEGFP-N2质粒共转染A549、HCT116及HEK-293细胞,48 h后倒置荧光显微镜观察EGFP的表达情况并用流式细胞仪检测平均荧光强度.结果 凝胶电泳和测序比对均显示RNAi表达框架与设计的相符,二级结构预测显示,新型RNAi表达框架与人源性miRNA-30的二级结构高度相似;共转染该表达框架与pEGFP-N2质粒48 h后,倒置荧光显微镜观察结果显示,3种细胞的荧光强度均明显减弱,流式细胞仪检测结果显示,3种细胞中共转染组与单独转染组相比平均荧光强度的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 新型RNAi表达框架构建成功,且能有效干扰EGFP在A549,HCT116和HEK-293细胞中的表达.
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新型人工miRNA表达框架的构建及其有效性验证
目的 构建针对EGFP基因的人工miRNA表达框架并验证其有效性.方法 用融合PCR技术在体外构建针对EGFP基因的人工miRNA表达框架.经测序比对后,以该表达框架与报告基因质粒pEGFP-N2分别共转染人肝癌细胞系HepG2、人宫颈癌细胞系HeLa和人肺腺癌细胞系A549,48 h后用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况并用流式细胞仪定量检测其抑制效率.结果 构建的人工miRNA表达框架经测序比对正确;共转染该表达框架和报告基因质粒pEGFP-N2后,倒置荧光显微镜观察结果显示,3种细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低.流式细胞术检测结果显示,HepG2细胞、HeLa细胞和A549细胞中共转染组和单独转染组的细胞荧光表达率差异均有统计学意义(t分别为20.80、30.35和20.34,P均＜0.01).结论 成功构建靶向EGFP的人工miRNA表达框架,且此表达框架能有效而特异地抑制EGFP蛋白在HepG2细胞、HeLa细胞和肺癌A549细胞中的表达.
关键词： 人工miRNA表达框架 EGFP基因 HepG2细胞 Hela细胞 A549细胞
