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中华按蚊细胞色素P450基因表达特征分析
目的 探讨6种溴氰菊酯抗性候选细胞色素P450(CYP)基因(CYP6M3、CYP6Y1、CYP6P5、CYP4H14、CYP4G17、CYP12F16)在中华按蚊体内的表达特征.方法 收集中华按蚊不同发育时期(卵、幼虫、蛹、雌性成蚊和雄性成蚊)和组织(唾液腺、马氏管、中肠、卵巢以及脂肪体)样本,以及雌性成蚊在暴露于不同溴氰菊酯剂量(0、1.25、3.75、6.25、12.5 μg/瓶)和时间(0,5、15、30、60 min)后的样本.提取总RNA,利用反转录实时定量PCR(qPCR)技术分析CYP6M3、CYP6Y1、CYP6P5、CYP4H14、CYP4G17、CYP12F16基因在中华按蚊不同发育时期、组织以及不同溴氰菊酯接触剂量和时间下的相对表达量.结果 CYP6M3与CYP6Y1基因在雄性中华按蚊成蚊体内的表达量高,CYP6M3基因在雄性成蚊体内的表达量是雌性成蚊的35.1倍,CYP6Y1基因在雄性成蚊体内的表达量是雌性成蚊的61.4倍;CYP4H14基因在幼虫期表达量低,且在雌性成蚊体内表达量是四龄幼虫体内表达量的22.5倍.候选CYP基因在中华按蚊不同组织内的表达量差异具有统计学意义,CYP6M3基因在马氏管内的表达量是在卵巢中的38.9倍,CYP6Y1基因在脂肪体内的表达量是在卵巢中的9.1倍,CYP6P5基因在中肠内的表达量是在卵巢中的30.3倍,CYP4G17基因在脂肪体内的表达量是在卵巢中的4.6倍,CYP12F16基因在马氏管内的表达量是在卵巢中的4.4倍.接触不同溴氰菊酯剂量和时间对候选CYP基因的表达水平表现出一定的诱导效应,影响候选CYP基因在中华按蚊体内的表达.结论 候选CYP基因在不同发育期中华按蚊体内和不同组织中差异表达,暴露于不同溴氰菊酯剂量和时间影响CYP基因在中华按蚊体内表达.
关键词： 中华按蚊 溴氰菊酯 细胞色素P450基因 表达特征 -
负载人细胞色素P4502B6基因的复制缺陷型腺病毒感染前列腺癌PC-3细胞的研究
目的 探讨负载人细胞色素P450(CYP2B6)基因的复制缺陷型腺病毒感染PC-3前列腺癌细胞的效果及CYP2B6表达.方法 将负载CYP2B6基因的复制缺陷型腺病毒以200 VP/cell的感染复数(MOI),感染人前列腺癌PC-3细胞；采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测PC-3细胞内CYP2B6的表达丰度,并以Western blot检测CYP2B6蛋白表达水平.结果 与阴性对照腺病毒比较,负载CYP2B6基因的腺病毒感染PC-3细胞后,可显著提高PC-3细胞CYP2B6mRNA表达水平(8.12±2.41比0.92±0.19,P＜0.05)及CYP2 B6蛋白表达水平(0.82±0.23比0.12±0.06,P＜0.05)；而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组PC-3细胞表达CYP2B6 mRNA(0.78±0.27比0.92±0.19)和CYP2B6蛋白(0.14±0.03比0.12 ±0.06)的水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可向前列腺癌PC-3细胞中有效导入CYP2B6基因,并在PC-3细胞中表达.
关键词： 前列腺癌 细胞色素P450基因 复制缺陷型腺病毒 -
巢式PCR法构建人细胞色素P4501A1基因cDNA全长T载体
目的构建含限制性内切酶位点KpnI,XhoI的人细胞色素氧化酶(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体.方法从培养的MCF-7细胞中抽提总RNA并根据人细胞色素P4501A1(CYP1A1,GeneBank NM000499)开放阅读框设计两对引物,采用巢式-PCR方法扩增CYP1A1 mRNA全长,凝胶分离并回收扩增的DNA片断,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5a,挑选3个阳性克隆,扩增培养后抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析.结果重组质粒PCR扩增得到1568的片段,KpnI,XhoI限制性内切酶消化质粒证实目的片断成功插入至载体,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1 mRNA的序列同源性为99.9%.结论该实验成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体克隆,巢式-PCR是一种简便、特异、灵敏的方法,可用于基因的检测和载体的构建.
关键词： 巢式-PCR 细胞色素P450基因 T载体 测序分析
