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表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体.方法 根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为pGC-FU-Cdh1.对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定.将293T细胞按完全随机法分为实验组(每组3只)及对照组(每组3只),分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞,倒置荧光显微镜观察后,Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况,慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定. 结果 重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中；转染293T细胞后,Western blot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1 -GFP的表达(每组3只),对照组无Cdh1-GFP的表达(n=0)(P=0.014)；慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,Reahime PCR法测定滴度为2E+8 TU/ml. 结论 成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1,并包装为慢病毒,为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础.
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氧糖剥夺对体外培养大鼠星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及机制
目的 探讨氧糖剥夺对星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及其机制.方法 ①体外纯化培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,随机分为对照组、氧糖剥夺1 h复氧组、氧糖剥夺6 h复氧组,Western blot检测Cdh1及Skp2蛋白的表达变化;②将体外纯化培养的星形胶质细胞随机分为对照组、氧糖剥夺6 h组、单纯缺氧6 h组,Western blot检测Cdh1蛋白的表达变化,血糖仪检测培养液中葡萄糖含量的变化.结果 ①与对照组相比,氧糖剥夺1 h复氧组、氧糖剥夺6 h复氧组Cdh1蛋白表达均下降,Skp2蛋白表达均增加(P＜0.05),氧糖剥夺1 h复氧组与氧糖剥夺6 h复氧组组间Cdh1、Skp2蛋白表达差异无统计学意义;②与对照组相比,氧糖剥夺6 h组Cdh1蛋白表达明显下降,单纯缺氧6 h组没有明显变化,氧糖剥夺6 h组与单纯缺氧6 h组组间差异有统计学意义(P＜0.05);③单纯缺氧6 h组细胞外液葡萄糖摄取率低于对照组(即常氧组)[(21.43±6.74)% vs.(26.98±9.21)%,P＜0.05].结论 氧糖剥夺后星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达减少,其变化与细胞外液中缺少葡萄糖有关.
