首页 > 文献资料
-
SNCG基因转染对PC-3细胞抗肿瘤药物作用效果的影响
目的:观察转染了质粒PCI-NEO-SNCG后的前列腺癌激素非依赖性细胞系PC-3细胞对抗肿瘤药物顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(TAX)的敏感性,探讨SNCG的表达对各种抗肿瘤药物作用效果的影响. 方法:转染质粒PCI-NEO和PCI-NEO-SNCG至PC-3细胞.采用RT-PCR法检测PC-3细胞中SNCG的表达;MTT法检测各抗肿瘤药物对转染后PC-3细胞的抑制作用;流式细胞术分析转染细胞经TAX作用后的细胞周期及凋亡. 结果:5种抗肿瘤药物对转染了空载体PCI-NEO质粒及PCI-NEO-SNCG质粒细胞的生长抑制作用均存在时间依赖性;转染PCI-NEO的PC-3细胞组与转染PCI-NEO-SNCG的PC-3细胞组中各种抗肿瘤药物的抑制效果比较显示,DDP、5.FU、ADM、VCR的抑制效果两组间没有显著性差异(P>0.05),而TAX对转染PCI-NEO-SNCG的细胞的抑制率较转染PCI-NEO的细胞显著降低(P<0.01);经TAX处理48 h后,在转染PCI-NEO质粒的细胞中,停留在G2-M期的细胞比例显著高于转染PCI-NEO-SNCG质粒的细胞(P<0.01),而停留在C0-C1期及S期的细胞比例,在转染PCI-NEO质粒的细胞中显著低于转染PCI-NEO-SNCG质粒的细胞(P<0.01);在转染PCI-NEO质粒的细胞中caspase-3的表达显著高于转染PCI-NEO-SNCG质粒的细胞(P<0.01). 结论:TAX对转染了SNCG基因的PC-3细胞中的生长抑制作用明显降低,提示SNCG的表达可抑制TAX的作用效果,这一发现可为前列腺癌的个体化治疗提供理论依据和指导.
-
人SNCG基因shRNA慢病毒载体质粒的构建及鉴定
目的：构建人SNCG基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体质粒，并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A 和 Ishikawa 细胞 SNCG mRNA 和蛋白的表达变化。方法设计3种 SNCG 基因特异性 shRNA 序列 SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3，用脂质体 Lipofectamine 2000在293T 细胞构建成慢病毒载体质粒。用 SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒转染人子宫内膜癌 HEC-1-A 和 Ishikawa 细胞，用实时荧光定量 PCR 法检测SNCG mRNA，用 Western blot 法检测 SNCG 蛋白。结果利用 Age Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切连接转化后的3组阳性转化子，1％琼脂糖凝胶电泳，特异条带与预计结果相符。Chromas Lite 比对分析基因测序结果，鉴定结果与 GenBank 数据库一致，表明合成的3对 SNCG shRNA 序列 SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3插入正确。HEC-1-A 和 Ishikawa细胞转染 SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒后 SNCG mRNA 和蛋白的表达均显著降低（P 均＜0．05）。结论成功构建了3种 SNCG shRNA 慢病毒载体质粒，用其转染 HEC-1-A 和 Ishikawa 细胞后可有效沉默SNCG 基因表达。
-
RNA干扰抑制γ突触核蛋白的表达对人结肠癌细胞株增殖和侵袭能力的影响
目的 探讨抑制γ突触核蛋白(SNCG)基因表达对结肠癌细胞株生长及侵袭能力的影响.方法 针对SNCG基因的mRNA序列(GENBANK:No.NM003087.2),设计合成干扰SNCG基因表达的RNA(siRNA)有效靶序列及其DNA,与慢病毒骨架质粒GV115(hU6-MCS-CMV-EGFP)连接并包装,获得实验组慢病毒LV-SNCG-RNAi-EGFP,并用相同步骤构建阴性对照组慢病毒LV-SNCG-NC-EGFP.用两种重组慢病毒分别感染人结肠癌SW1116细胞(实验组:RNAi组,阴性对照组:NC组),荧光显微镜下观察感染后shRNA荧光标签(EGFP)的表达情况;利用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测RNAi组与NC组细胞中SNCG基因表达mRNA的干扰效果;以野生型SW1116细胞为空白对照(野生型组),用Western blot方法检测RNAi组、NC组和野生型组细胞中SNCG基因表达蛋白的干扰效果;CCK-8细胞增殖实验、 软琼脂克隆形成实验和Transwell侵袭实验,用于评价RNA干扰SNCG基因表达对RNAi组与NC组细胞的体外生长及侵袭能力的抑制作用.结果 成功构建并获得了稳定表达重组慢病毒的SW1116细胞株,表达慢病毒LV-SNCG-RNAi-EGFP及LV-SNCG-NC-EGFP滴度均为8×108 TU/ml.RNAi组SNCG基因相对表达水平(2-ΔΔCt)为0.114±0.030,低于于对照NC组的SNCG基因相对表达水平(2-△△Ct:1.009±0.161),差异有统计学意义(P=0.009);RNAi组SNCG基因干扰效率达到76.8%.RNAi组的SNCG蛋白相对表达量为12.001±2.884,低于NC组(蛋白相对表达量:32.445±4.731)和野生型组(蛋白相对表达量:34.308±6.920),差异有统计学意义(P=0.018,P=0.020).CCK-8细胞增殖实验显示,干扰SNCG基因表达后,RNAi组细胞的体外增殖能力从48 h开始受到明显抑制,并持续到120 h,与NC组及野生型组差异具有统计学意义(P=0.036).RNAi组克隆明显偏小,RNAi组平均直径(0.582±0.103)mm,低于NC组[(1.863±0.316)mm]及野生型组[(1.749±0.525)mm],差异具有统计学意义(P=0.003);RNAi组克隆形成率为(17.1±3.5)%,低于NC组[(36.5±4.3)%]及野生型组[(33.8±3.9)%],差异具有统计学意义(P=0.013,P=0.019).RNAi组的侵袭个数为(37.4±9.3)个,较NC组[(112.3±8.6)个]及野生型组[(100.0±0.0)个]明显减少,差异具有统计学意义(P=0.008,P=0.007).而NC组及野生型组在细胞增殖能力、克隆形成数量及侵袭能力方面的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 SNCG基因表达在结肠癌细胞的生长和侵袭能力方面具有重要作用.
