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尿源干细胞治疗海绵体神经损伤性勃起功能障碍大鼠模型的实验研究
目的:探讨尿源干细胞(USC)对海绵体神经损伤性勃起功能障碍(CNIED)大鼠勃起功能和阴茎海绵体组织结构的保护作用. 方法:60只成年雄性SD大鼠随机平均分为4组(n=15只/组):假手术组、双侧海绵体神经钳夹损伤组(BCNI组)、PBS组、USC组.假手术组予暴露双侧海绵体神经后直接关闭手术切口,其余3组均予血管钳钳夹双侧海绵体神经1 min,建立CNIED模型;PBS组和USC组分别予阴茎海绵体注射PBS(200μl)或USC(1×106细胞/200μlPBS).治疗28 d后测定大鼠的大海绵体内压(mICP)和mICP/平均动脉压(mICP/MAP),并通过Western印迹检测海绵窦内皮细胞标志物eNOS,平滑肌标志物α-SMA,以及Collagen I,通过免疫组化检测海绵体阴茎背神经内的神经标志物(nNOS、NF-200),Masson染色检测海绵体平滑肌/胶原比值,以及TUNEL染色检测海绵窦内细胞凋亡水平. 结果:治疗28 d后,USC组大鼠的mICP及mICP/MAP均较PBS组[(81±9.9) mmHg vs(31±8.3) mmHg,0.72±0.05 vs0.36±0.03,P＜0.0S]和BCNI组[(81±9.9) mmHg vs (33±4.2)mmHg,0.72 ±0.05 vs0.35 ±0.04,P＜0.05]显著升高.免疫组化结果显示:USC组大鼠背神经内nNOS、NF-200阳性神经纤维面积的比例(％)均较PBS组(11.31 ±4.22 vs 6.86 ±3.08,27.31±3.12 vs 17.38±2.87,P＜0.05)和BCNI组(11.31 ±4.22 vs 7.29 ±4.84,27.31 ±3.12 vs 19.49 ±4.92,P＜0.05)显著增加;Western印迹检测结果显示:USC组大鼠eNOS/GAPDH比值较PBS组(0.52 ±0.08 vs 0.31 ±0.06,P＜0.05)和BCNI组(0.52 ±0.08 vs 0.33±0.07,P＜0.05)均显著提高,α-SMA含量亦较PBS组(1.01 ±0.09 vs 0.36 ±0.05,P＜0.05)和BCNI组(1.01±0.09 vs 0.38 ±0.04,P＜0.05)显著提高,而Collagen I含量较PBS组(0.28 ±0.06vs0.68 ±0.04,P＜0.05)和BCNI组(0.28 ±0.06 vs 0.70 ±0.10,P＜0.05)显著降低;且Masson染色结果示USC组大鼠阴茎平滑肌/胶原比值(％)亦较PBS组(17.91 ±2.86 vs 7.70±3.12,P＜0.05)和BCNI组(17.91 ±2.86 vs 8.21 ±3.83,P＜0.05)显著升高.TUNEL染色显示USC组大鼠海绵窦内细胞的凋亡指数(％)较PBS组(3.31 ±0.83 vs 9.82 ±0.76,P＜0.01)和BCNI组(3.31 ±0.83 vs 9.75 ±0.91,P＜0.05)显著降低. 结论:USC可以通过保护神经、改善海绵窦内皮功能和海绵体纤维化,抑制细胞凋亡,显著保护CNIED大鼠的勃起功能.
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长链非编码RNA KCNQ1DN对尿源干细胞的干性调控研究
目的:探讨长链非编码RNA KCNQ1DN在尿源干细胞干性调控中的作用.方法:收集健康成人(n=6)尿液,提取尿源干细胞并传代培养,分别收集P3、P5和P7代尿源干细胞,并应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测KCNQ1DN基因表达水平.构建靶向干扰KCNQ1DN的慢病毒载体LV3-shKCNQ1DN,转染P2代尿源干细胞并培养96小时后荧光显微镜观察感染效率,RT-PCR检测KCNQ1DN的表达,CCK8法检测细胞的增殖,RT-PCR和Western blotting检测干性相关转录因子c-Myc、Nanog、Rex1的mRNA及蛋白的表达.结果:随着尿源干细胞传代代数的增加,KCNQ1DN的表达量逐渐升高(P＜0.05).shKCNQ1DN转染尿源干细胞后KCNQ1DN的表达显著降低(P＜0.01),敲低尿源干细胞中KCNQ1DN的表达能够促进尿源干细胞的增殖并上调干性相关转录因子c-Myc、Nanog和Rex1mRNA及蛋白的表达.结论:随着尿源干细胞的生长,长链非编码RNA KCNQ1DN的表达逐步被激活,并对尿源干细胞的干性起到负性调控作用.
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尿源干细胞治疗1型糖尿病性勃起功能障碍大鼠的实验研究
目的:验证尿源干细胞 (USCs) 治疗1型糖尿病性勃起功能障碍 (DED) 大鼠的效果及探索可能机制.方法:予10周龄SD雄性大鼠腹腔注射链脲佐菌素 (40 mg/kg) 以构建糖尿病大鼠模型, 8周后行阿扑吗啡 (APO) 颈部皮下注射筛选DED大鼠模型.随后分离、培养、鉴定USCs.将所有大鼠分为正常对照组 (n=6) 、PBS组 (n=6) 和USCs治疗组 (n=6), 其中PBS组和USCs治疗组均为DED大鼠.分别将PBS或USCs (1×106/只) 移植至PBS组和USCs治疗组大鼠阴茎海绵体.移植4周后分别比较三组大鼠的体重和血糖, 并测定平均颈动脉内压 (MAP) 和海绵体内压 (ICP) 以评价阴茎勃起功能, 分析其阴茎局部血管周细胞标志物、平滑肌/胶原比例、VEGF/VEGF/eNOS.结果:1型DED大鼠的成模率为75％.经流式分析证实USCs表达间充质干细胞表面标志物, 并至少可向成骨、成脂方向分化.USCs移植4周后, 除正常对照组大鼠体重保持增长外 (P<0.05), PBS组、USCs治疗组的体重无明显变化 (P>0.05).此外三组大鼠治疗前后血糖均无显著变化 (P>0.05).与PBS组比较, USCs治疗组的ICP及ICP/MAP均得到显著恢复 (P<0.01).免疫荧光证实1型DED大鼠的VEGF/VEGFR1/eNOS通路和阴茎海绵窦周细胞功能 (CD146) 均受损, 经USCs治疗4周后, 该通路及CD146均得到显著恢复, 平滑肌/胶原比例也得到有效恢复.结论:USCs可有效治疗1型DED大鼠, 其作用机制可能是通过VEGF/VEGFR1/eNOS通路改善阴茎海绵窦内皮功能实现的.
关键词： 尿源干细胞 糖尿病性勃起功能障碍 周细胞 -
儿童原发性肾病综合征尿源干细胞生物学特征研究
目的:探讨正常儿童尿源干细胞(urine-derived stem cell,USCs)与原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)患儿尿源干细胞(p-USCs)生物学特征差异.方法:收集正常儿童及PNS患儿清洁中段尿液,分离培养USCs及p-USCs,观察细胞形态差异;CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡及干细胞表面标志物(CD24、CD29、CD34、CD73、CD90、CD105、CD146);免疫荧光及Western blot检测细胞肾系标志物(Pax2)表达;Western blot检测细胞自噬水平.结果:PNS患儿尿液中存在2种形态p-USCs:p-USCs Ⅰ及p-USCsⅡ.p-USCs Ⅰ形态与正常USCs相似:米粒样、胞体较小、排列紧密.p-USCsⅡ胞体可见少量空泡,胞体较大,散在排列.USCs、p-USCs Ⅰ及p-USCsⅡ大传代次数分别为11代、8代及5代.与USCs比较,p-USCs增殖能力减弱,且p-USCsⅡ减弱更加明显(F=217.300,P=0.000);p-USCs细胞凋亡无明显差异;p-USCs干细胞表面标志物及周细胞表面标志物表达无统计学差异;p-USCs肾系标志物表达水平下降,且p-USCsⅡ下降更明显(F=26.930,P=0.001);p-USCs自噬水平下降,差异有统计学意义(F=15.060,P=0.000).结论:PNS患儿体内存在2种不同形态尿源干细胞:p-USCs Ⅰ及p-USCsⅡ.与USCs相比,p-USCs形态有差异、自我更新能力降低、肾系标志物表达下降、自噬水平减弱.
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尿源干细胞促进脊髓损伤后神经源性膀胱恢复
目的 观察大鼠神经源性膀胱模型功能和组织学变化,探索尿源干细胞对大鼠神经源性膀胱的修复治疗作用.方法 45只健康清洁的正常SD大鼠按照完全随机法分为正常组、损伤组、干细胞组,每组15只.治疗组建模7d后,尾静脉注射尿源性干细胞.28 d后,尿动力学检测大鼠尿动力各项指标,肌条实验观察膀胱收缩情况,Western blot观察P2Y4在膀胱中的表达,TUNEL染色观察细胞凋亡情况.结果 干细胞组大鼠膀胱湿质量(0.31±0.01)g和膀胱湿质量/体质量值(1.19±0.41)、尿动力指标[收缩时间(112.75±16.52)s、离体膀胱逼尿肌肌条指标[收缩时间(16.47 ±2.29)s]、膀胱肌细胞凋亡率(28.22±11.08)％均优于损伤组[膀胱湿质量(0.66 ±0.07)g,膀胱湿质量/体质量值(2.30±0.26),尿动力指标:收缩时间(59.00 ±5.68)s,离体膀胱逼尿肌肌条指标:收缩时间(19.80 ±3.77)s,膀胱肌细胞凋亡率(59.80 ±14.18)％].Western blot检测结果显示干细胞组的蛋白P2Y4的表达低于损伤组.结论 尿源干细胞可促进脊髓损伤后大鼠神经源性膀胱的功能恢复.
