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天疱疮患者皮损局部异位淋巴结构的病理学特征
目的 探讨天疱疮患者皮损处浸润淋巴细胞病理学特征及其与外周血抗桥粒黏蛋白(Dsg) 1/Dsg3抗体滴度的相关性.方法 对2014-2016年上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科93例寻常型和落叶型天疱疮患者的组织病理片进行分析.计算每例×50镜下淋巴细胞总数,定义为淋巴细胞密集程度指数.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定天疱疮患者血清中抗Dsg1/Dsg3抗体滴度.统计淋巴细胞密集程度指数与抗体滴度间相关性.对其中8例寻常型和8例落叶型天疱疮患者的皮损样本进行免疫组化染色,分析CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD138+浆细胞的分布.结果 在93例病理切片中,Grade1、Grade2、Grade3淋巴细胞聚集出现概率分别为100.00％、68.09％、10.64％,寻常型(56例)和落叶型天疱疮(37例)比较,Grade1-3淋巴细胞聚集出现概率差异无统计学意义.淋巴细胞的密集程度在寻常型和落叶型天疱疮患者比较,差异无统计学意义,与天疱疮患者血清中特异性抗Dsg1和抗Dsg3的抗体滴度无相关性.在16例天疱疮病例中,全部有CD3+T细胞出现,15例有CD20+B细胞,12例有CD138+浆细胞存在.16例切片中,Grade1-3淋巴细胞聚集区域中均含有大量的CD3+T细胞,而含有CD20+B细胞的淋巴细胞聚集占总数的52.80％±5.78％,含有CD138+浆细胞的淋巴细胞聚集占总数的34.59％±7.42％.CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD138+浆细胞在寻常型(8例)和落叶型天疱疮(8例)分布差异无统计学意义.结论 天疱疮患者皮损处普遍出现不同程度的淋巴细胞浸润,可能形成异位淋巴结构,参与皮损的形成和加重.
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胆碱能受体激动剂逆转天疱疮棘层松解的机制研究
目的 研究胆碱能受体激动剂对天疱疮棘层松解的逆转作用及其机制.方法 将HaCaT细胞与寻常型天疱疮IgG(PV-IgG)共培养建成天疱疮细胞模型后,再加入胆碱能受体激动剂卡巴胆碱共培养,以PV-IgG诱导的天疱疮细胞模型作为对照,通过细胞解离实验定量分析卡巴胆碱对棘层松解的逆转情况,用免疫荧光方法定性观察桥粒蛋白变化;分别用RIPA和Triton X-100裂解细胞,得到总蛋白和胞质蛋白,用蛋白免疫印迹灰度值定性分析HaCaT细胞表面与黏附相关的桥粒芯蛋白3(Dsg3)、桥斑珠蛋白(PG)的变化,不同时间点p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化水平;用定量聚合酶链反应(qPCR)检测上述细胞表面蛋白在mRNA水平的变化;通过免疫共沉淀方法定性分析Dsg3与PG相互作用的变化情况.结果 PV-IgG组细胞碎片数为46.67±2.03,卡巴胆碱组为18.67±2.52,两组比较,t=11.22,P＜ 0.01;免疫荧光实验发现,卡巴胆碱可以逆转PV-IgG所致的桥粒分子内化.在天疱疮细胞模型中,细胞总的Dsg3和PG含量下降,非桥粒部分的Dsg3下降,非桥粒PG含量增加,且Dsg3与PG的相互作用减弱,加入卡巴胆碱后可逆转上述变化.卡巴胆碱也可使Dsg3 mRNA的相对表达量(2-△△Ct)由1.428±0.215增加至4.974±0.948(t=3.65,P=0.01),PG mRNA的相对表达量由1.563±0.247增加至13.420±1.715(t=6.85,P＜0.01).磷酸化实验中,卡巴胆碱可以抑制EGFR磷酸化,而对p38 MAPK磷酸化无明显影响.结论 胆碱能受体激动剂卡巴胆碱具有逆转棘层松解的作用,这种逆转作用的机制可能包括:抑制Dsg3和PG内化并增加其表达,增强Dsg3与PG的相互作用,抑制棘层松解关键信号EGFR的磷酸化.
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桥粒芯糖蛋白1、3在HaCaT细胞、A431细胞及原代角质形成细胞中的表达
目的 测定不同类型角质形成细胞(KC)桥粒芯糖蛋白(DSG)1、DSG3及DSG1 mRNA、DSG3mRNA表达.方法 不同KC(HaCaT细胞、A431细胞及原代KC)培养后,直接免疫荧光观察细胞DSG1、DSG3的表达,定量聚合酶链反应(qPCR)测定DSG1 mRNA、DSG3 mRNA相对表达水平.结果 DSG1与DSG3表达于三种角质形成细胞,荧光强度显示,A431细胞高于HaCaT细胞,HaCaT细胞高于原代KC.三种细胞均表达DSG1、DSG3 mRNA,原代KC DSG1与DSG3 mRNA的相对表达量分别为HaCaT细胞的291.7％及237.4％,差异有统计学意义(P＜0.01)；A431细胞DSG1 mRNA为HaCaT细胞的0.1％、DSG3 mRNA则为HaCaT细胞的18.8％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 三种KC均可用于对DSG1、DSG3的相关研究；相对而言,正常培养的A431细胞表面DSG1、DSG3表达较HaCaT细胞及原代KC高；原代KC DSG1、DSG3mRNA水平较HaCaT细胞及A431细胞高.
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桥粒芯糖蛋白3刺激下寻常型天疱疮患者外周血T淋巴细胞增殖检测分析
目的 观察桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)对寻常型天疱疮(PV)患者外周血T淋巴细胞增殖的影响.方法 PV患者12例,正常人22例,提取外周血单一核细胞(PBMC),采用流式细胞仪技术分别检测Dsg3刺激下PBMC中T淋巴细胞亚群变化及T淋巴细胞增殖情况,分析PV患者与正常人之间存在的差异.结果 PV患者PBMC在Dsg3刺激下Th2型T淋巴细胞所占比例为12.17%±5.32%,Th1型T淋巴细胞所占比例为4.08%±1.50%;未经Dsg3刺激的阴性对照组分别为9.84%±5.41%和3.91%±1.38%.PV患者PBMC在Dsg3刺激和无Dsg3刺激时的Th2型T淋巴细胞所占比例均显著高于正常人(P
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利用噬菌体随机9肽库筛选寻常型天疱疮抗原模拟表位
目的 利用噬菌体随机9肽库筛选寻常型天疱疮抗原桥粒芯糖蛋白3(desmoglein,Dsg3)模拟表位,加深对寻常型天疱疮发病机制的认识. 方法 通过大肠杆菌表达Dsg3的胞外结构域1和2(extracellular domain,EC1-2)和谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白,从寻常型天疱疮患者血清中纯化与EC1-2特异结合的多克隆抗体,对噬菌体随机线九肽库和环九肽库进行亲和筛选,阳件噬菌体展示肽经ELISA和竞争性ELISA验证. 结果 经过两轮亲和筛选,与自身抗体结合的噬菌体明显富集,免疫筛查、验证后得到3个阳性噬菌体展示肽,ELISA检测显示它们与患者血清反应,而不与正常人血清反应,竞争性ELISA检测显示它们可以抑制寻常型天疱疮患者血清与重组蛋白EC1-2的结合. 结论 利用噬菌体随机9肽库筛选到3个与寻常性大疱疮密切相关的模拟表位.
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天疱疮患者皮损局部B淋巴细胞及其产生特异性抗体的功能研究
目的 检测寻常型天疱疮患者皮损局部B淋巴细胞及其产生特异性抗体的功能.方法 寻常型天疱疮患者35例,健康对照22例.取健康对照皮肤和寻常型天疱疮患者初发水疱或糜烂皮损组织,分离获得单个核细胞.流式细胞仪检测患者皮损局部淋巴细胞、CD19+B细胞比例,以及特异性识别桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3的CD19+B淋巴细胞比例.体外培养寻常型天疱疮患者皮损局部淋巴细胞,ELISA法检测培养上清液中抗Dsg1和Dsg3抗体滴度,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析阳性率.结果 寻常型天疱疮患者皮损局部淋巴细胞、CD19+B细胞比例分别为17.95％±3.85％、4.27％±1.13％,高于健康对照组(7.83％±1.29％、0.61％±0.31％),差异有统计学意义(t=2.49,U=13.00,均P＜0.05).天疱疮患者皮损局部CD19+B淋巴细胞中,表达IgG的细胞比例为(38.33±5.56)％,表面识别Dsg1与Dsg3的细胞比例分别为12.87％±1.267％、10.42％±1.243％.局部淋巴细胞体外培养6d后,培养上清液中抗Dsg1与Dsg3抗体滴度分别为(4.89±1.56) U/ml、(35.45±13.03) U/ml,阳性率分别为85％ (17/20)和95％(19/20).结论 寻常型天疱疮患者皮损局部有可与Dsg1及Dsg3特异性结合的B淋巴细胞聚集,体外培养后可产生特异性抗Dsg1与抗Dsg3自身抗体.
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71例天疱疮的棘层松解位置分析
目的 探讨天疱疮的棘层松解位置,为天疱疮出现不同位置棘层松解的表现提供解释.方法 收集43例寻常型天疱疮和28例落叶型天疱疮患者的临床资料、组织病理、免疫病理、天疱疮抗体指标值进行分析.结果 寻常型天疱疮中有35例棘层松解的位置发生在基底层上方,8例发生在表皮中上部,落叶型天疱疮中有25例棘层松解的位置发生在颗粒层、棘层上方,3例发生在表皮中下部,落叶型天疱疮患者抗Dsg1抗体指标较寻常型天疱疮患者显著升高(P=0.047),寻常型天疱疮棘层松解的位置发生在表皮中上部的患者抗Dsg1、3抗体指标值与棘层松解发生在基底层上方的患者相比有差异,但无统计学意义.结论 寻常型天疱疮及落叶型天疱疮患者组织病理中,棘层松解的位置可发生于表皮中上部、表皮中下部.棘层松解的位置可能与抗Dsg1抗体和抗Dsg3抗体指标值等相关.
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天疱疮患者抗桥粒芯糖蛋白与疾病相关性分析
目的：探讨酶联免疫吸附测定（ELISA ）检测血清桥粒芯糖蛋白（Dsg ）1和Dsg3在天疱疮诊断及治疗中的应用价值。方法选择2014年1～12月在该科确诊为天疱疮的患者47例（观察组），同期排除天疱疮的患者52例为对照组。间接免疫荧光法（IIF）检测抗表皮棘细胞桥粒抗体，ELISA检测Dsgl、Dsg3；分析其与天疱疮病情的相关性。结果 ELISA法的敏感性为95．74％，特异性为92．31％。IIF法敏感性为93．62％，特异性为86．54％。二者比较差异无统计学意义（P＞0．05）。30例寻常型天疱疮患者16例Dsg1、Dsg3均阳性，8例红斑型和5例落叶型天疱疮患者均只有Dsg1阳性，2例增殖型天疱疮Dsg1、Dsg3均为阳性。寻常型和增殖型天疱疮Dsg1、Dsg3滴度分别为130．85±86、112．30±85．05，疾病活动性评分（5．10±1．86）分，相关系数分别为 r＝0．476（P＝0．008）、r＝0．816（P＝0．001）。落叶型和红斑型天疱疮Dsg1滴度142．59±78．52，疾病活动评分平均为（2．77±0．92）分，r＝0．800，P＝0．001。结论 ELISA检测Dsg1、Dsg3敏感性、特异性高，有助于天疱疮的诊断及病情严重程度的评价。
