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人胚胎表皮角蛋白细胞分化中PAI-2表达的研究
目的通过研究人胚胎期表皮分化中PAI-2的表达及变化规律,探讨PAI-2与人表皮角蛋白细胞的关系. 方法用免疫细胞化学及原位杂交技术对早、中、晚期人胚胎表皮角蛋白细胞染色,观察PAI-2蛋白及其mRNA原位分布、合成情况;用免疫细胞化学及核酸斑点杂交实验检测离体培养的人胚胎表皮角蛋白细胞中PAI-2的表达情况. 结果 PAI-2在人胚胎期主要存在于分化程度高的表皮浅层角蛋白细胞内.胚胎期的表达高峰在胚胎中期,胚胎晚期其蛋白水平开始降低,而mRNA则维持在相对高位.PAI-2聚集于原位及离体培养的角质蛋白细胞胞浆近胞膜处. 结论 PAI-2可能参与了表皮角蛋白细胞分化的调控.
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抑制环氧化酶-2-前列腺素E2通路介导硫化氢保护人皮肤角质形成细胞对抗化学性缺氧引起的损伤
目的 探讨环氧化酶(COX)-2-前列腺素(PG)E2通路在硫化氢(H2S)保护人皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)对抗化学性缺氧引起的损伤中的作用.方法 用化学性缺氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理HaCaT细胞,建立缺氧引起皮肤损伤的体外模型.在CoCl2处理前,用不同浓度的H2S的供体硫氢化钠(NaHS)预处理30 min,检测H2S对CoCl2引起的细胞损伤的影响；应用细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测细胞存活率.酶联免疫法(ELISA)检测培养基中PGE2的水平.Western印迹法检测COX-I和COX-2蛋白的表达.结果 500 μmol/L CoCl2处理HaCaT细胞24 h可以明显降低绌胞存活率[(56.3±5.4)％],促进PGE2的释放[(395.7±65.0)％]以及上调COX-2的表达(均P＜0.01).CoCl2处理对HaCaT细胞内COX-I的表达无明显影响(P＞0.05).在200～400μmol/L的浓度范围内,NaiIs预处理可明显拮抗CoCl2引起的细胞存活率降低、PGE2的释放增加以及COX-2表达上调.选择性COX-2抑制剂(NS-398)也能抑制CoCl2处理引起的细胞存活率降低.结论 H2S可保护人皮肤角质形成细胞对抗化学性缺氧引起的损伤,其机制与抑制COX-2-PGE2通路有关.
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氨对人表皮角质细胞生长和代谢的影响
目的 了解人表皮角质细胞培养过程中,氨对细胞生长和代谢的影响.方法 收集3～6岁健康幼儿包皮,以Dispase Ⅱ分离、收集原代细胞,角质化细胞专用无血清培养基(Keratinocyte-SFM)培养.待细胞培养至第4代,更换含不同氨浓度的培养基,考察细胞生长和代谢的变化.结果 氨抑制了细胞的生长,当氨的浓度为9.23 mmol/L时,脉冲培养结束时的活细胞密度(0.84×105个/ml)进一步下降,细胞存活率下降至54.5%;氨对细胞生长的抑制作用遵循二级抑制模型,其模型常数Ka为4.46(mmol/L)2,即当氨的浓度为2.11 mmol/L时,细胞的比生长速率下降到大比生长速率的50%.当氨浓度从1.23 mmol/L增加到1.73mmol/L,细胞对葡萄糖的得率系数下降了48.0%,葡萄糖的比消耗速率上升了14.8%;与氨浓度为1.23 mmol/L相比,9.23 mmol/L的氨使乳酸对葡萄糖的得率系数增加了12.0%,乳酸的比生成速率增加了53.3%.氨浓度的增加明显改变了细胞的代谢,促进了细胞对葡萄糖的利用,消耗的葡萄糖更倾向于乳酸的生成.当氨浓度为9.23 mmol/L,谷氨酰胺的比消耗速率和氨的比生成速率分别是氨浓度为1.23 mmol/L的20.2%和6.2%.氨抑制了谷氨酰胺的消耗,谷氨酰胺在生成谷氨酸后经过脱氢途径的流量减少,更多地向转氨途径,即低效率的产能途径偏移.结论 在人表皮角质细胞的培养过程中,应尽量减少氨的积累.
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腹膜假性黏液瘤的CT征象及其与免疫组化的关系
目的:通过分析腹膜假性黏液瘤(pseudomyxoma peritonei,PMP)的CT资料,提高对本病CT征象的认识.方法:回顾性分析52例临床确诊的PMP患者的临床和影像资料,总结CT影像特点及与细胞角蛋白(cytokeratins,CK)和上皮膜抗原(epithelial membrane antigen,EMA)的关系.结果:52例患者均表现为全腹腔及盆腔积液,37例可见明显多发腔隔形成,43例可见网膜饼形成,52例见肝脏侵犯,40例见脾脏侵犯,30例可见明显扇贝征,3例出现腹壁侵犯,14例出现钙化灶.CK阳性组28例,1 2例见扇贝征;CK阴性组1 5例,12例见扇贝征.EMA阳性组13例,9例见扇贝征;EMA阴性组24例,8例见扇贝征.CK、EMA的阳性组与阴性组在扇贝征分布方面差异具有统计学意义;而在其他CT征象(游离积液、腔隔、网膜饼征)上,差异均无统计学意义.结论:PMP的CT征象具有一定的特征性,扇贝征与CK、EMA可能有一定的相关性.
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甘石青黛膏对大鼠湿疹模型皮损角质形成细胞与淋巴细胞凋亡的影响
目的观察甘石青黛膏对大鼠湿疹模型皮损角质形成细胞与淋巴细胞的凋亡的影响。方法大鼠湿疹模型造模成功后进行中药甘石青黛膏干预，并与安慰剂（白凡士林膏）对比，采用TUNEL法检测治疗组和对照组大鼠湿疹模型皮损角质形成细胞与淋巴细胞的凋亡情况。结果角质形成细胞与淋巴细胞的凋亡情况是空白组大鼠皮肤在实验0 d和14 d均可见少量凋亡细胞，两者相比没有统计学差异（ P＞0.05）；安慰剂组大鼠皮损干预前可见少量凋亡细胞，干预后凋亡细胞数量增加，与治疗前相比较具有统计学差异（ P＜0.05）；甘石青黛膏组大鼠皮损干预前可见少量凋亡细胞，与安慰剂组相比无统计学差异，干预后凋亡细胞数量明显增加，与治疗前相比较具有统计学差异（ P＜0.001）；安慰剂组和甘石青黛膏组治疗后相比，具有统计学差异（ P＜0.000），后者优于前者。结论甘石青黛膏对大鼠湿疹模型皮损具有抑制角质形成细胞增殖和促进角质细胞和淋巴细胞凋亡作用。
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乳腺癌淋巴管侵犯与淋巴结转移率的相关性研究
目的 探讨乳腺癌组织中淋巴管侵犯(LVI)与淋巴结转移率(LNR)的关系.方法 采用免疫组织化学法,用单克隆抗体D2-40及CK pan检测118例乳腺癌患者蜡块组织标本的LVI阳性率.结果 118例乳腺癌组织的LVI阳性率为37.3%(42/118);LVI阳性率与LNR、淋巴结转移数目、组织学分级呈正相关(χ2= 9.186、6.996、18.340,P=0.010、0.030、0.000).结论 LVI可作为判断乳腺癌发生腋窝淋巴结转移的重要参考指标,且LNR越高,LVI发生率越高.
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N0期31例胃癌患者区域淋巴结组织中CK19的表达
目的:探讨常规染色显示无淋巴结转移的胃癌患者淋巴结微转移发生情况以及预后意义.方法:回顾性分析31例常规染色提示无淋巴结转移的胃癌患者(T1-3N0M0),将常规检查阴性的淋巴结用CK19单克隆抗体进行免疫组织化学染色.结果:31例常规病理检查无淋巴结转移的患者中位随访期为50个月,所切除淋巴结的中位数为8个,总的5年生存率为53.7%,其中通过免疫组化发现的微转移检出率为32.3%(10/31).淋巴结微转移患者5年生存率为30%,低于无微转移患者的66.5%,P=0.036.结论:CK19的免疫组化染色是检测胃癌淋巴结微转移的敏感易行的方法,且微转移的检测有助于明确分期、判断预后及指导治疗.
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细胞角蛋白18和13在术后性上颌囊肿化生上皮中的表达
目的研究口腔术后性颌骨囊肿(POMC)化生上皮起源以及细胞角蛋白(CK)在鳞状化生细胞中的表达.方法采用免疫组化SP法、原位杂交法和RT-PCR法,分别检测46例POMC中细胞角蛋白的表达情况.其中13例囊肿衬里上皮只含有假复层纤毛柱状上皮细胞;30例囊肿衬里既含有纤毛柱状上皮细胞,又含化生的鳞状上皮细胞;3例囊肿衬里只含有化生的鳞状上皮细胞.结果43例纤毛柱状上皮细胞中,39例表达CK8,9例表达CK13,43例均有CK18表达.发生鳞状上皮化生的细胞中CK13表达较多,CK8和CK18表达较少.在33例发生化生的囊肿衬里中,24例表达CK8,23例表达CK13,26例表达CK18.CK13和CK18蛋白的表达与CK13、CK18-mRNA表达水平相关.原位杂交方法检测CK1g-mRNA表达时发现,26例CK18蛋白阳性的化生囊肿衬里上皮以及7例发生化生但不表达CK18蛋白的囊肿衬里上皮都有CK18-mRNA的表达.RT-PCR结果进一步证明所有发生鳞状化生的囊肿衬里上皮都有CK18-mRNA的表达,但是其表达水平较未发生化生的柱状细胞囊肿衬里上皮弱,而且CK13-mRNA的表达与CK18-mRNA表达相反.结论在发生上皮化生的全过程中,CK18-mRNA保持不变,但是其蛋白的表达水平下降,而且发生鳞状化生时CK18表达减少,CK13表达增加.
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人源性角质细胞生长因子(KGF)的克隆及其表达分析
目的:克隆出正确的人源性角质细胞生长因子(KGF)并探讨影响其表达的因素.方法:应用RT-PCR技术克隆出KGF基因,并用pBV220表达质粒对其进行表达,然后用RNAdraw对其RNA进行分析.结果:带有信号肽的KGF基因在pBV220中表达量为10%左右,而去掉信号肽的KGF基因在pBV220中表达量估计只有1%～2%;利用RNAdraw分析的结果表明前者RNA前端没有形成茎环结构,而后者则形成了茎环结构.结论:KGF基因在细菌中表达量较低,信号肽是影响其表达量的重要因素.
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人胚胎干细胞分化为角质形成细胞过程中标志物的表达特点
目的：诱导人胚胎干细胞（ human embryonic stem cells，hESCs）定向分化为角质形成细胞K-hESCs（ kerati-nocyte derived from human embryonic stem cells），并分析诱导过程中K-hESCs不同标志物的表达特点。方法：运用含骨形成蛋白4、维甲酸和N2添加剂的上皮分化培养基直接诱导hESCs分化为K-hESCs，通过染色体核型分析检测K-hESCs核型，通过实时定量PCR检测K-hESCs在分化的不同时期基因的表达及其与原代人牙龈上皮细胞（ hu-man gingival epithelial cells，HGECs）、人永生化口腔上皮细胞（ human immortalized oral epithelial cells，HIOECs）、人永生化皮肤角质形成细胞HaCaT的基因表达差异；利用免疫组织化学检测不同标志物在K-hESCs的蛋白表达。结果：运用上皮分化培养基成功地诱导hESCs分化为上皮样细胞K-hESCs；K-hESCs核型具有正常46条染色体，无结构异常；K-hESCs中角质形成细胞标志物基因p63的表达明显低于HaCaT细胞（P＜0．05），而与HGECs和HIOECs中的表达差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论：运用上皮分化培养基可成功诱导hESCs分化为具有正常核型的K-hESCs；标志物的表达特点提示诱导hESCs分化为K-hESCs的过程是从hESCs向单层上皮干细胞分化继而转向复层上皮终末分化发展的趋势，终得到的K-hESCs类似于单层鳞状上皮干细胞向终末分化初始阶段的角质形成细胞，该阶段的细胞由上皮干细胞静止状态被激活，处于分化初始高增殖活力阶段。
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钙泊三醇对人角质形成细胞S100A8基因表达的影响
目的 探讨钙泊三醇对人角质形成细胞抗菌肽S100A8基因表达的影响.方法 体外培养的HaCaT细胞,分为空白对照组、加入100 ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)的TNF-α组、加入10-5 ～ 10-9 mol/L钙泊三醇的钙泊三醇组、TNF-α与钙泊三醇共同刺激的TNF-α+钙泊三醇组,所有细胞共同孵育24 h.实时定量PCR法检测并计算S100A8 mRNA相对表达量.结果 100 ng/mlTNF-α处理HaCaT细胞后24 h,S100A8 mRNA表达较空白对照上调(19.623 ±3.486)倍(P＜0.01);10-7、10-8 mol/L钙泊三醇处理细胞24 h后,S100A8表达分别较空白对照上调(5.029±1.056)、(2.848 ±0.612)倍(均P＜0.01).10-5 mol/L钙泊三醇与TNF-α共同处理细胞后,S100A8表达下调为单独使用TNF-α时的(59.51±3.31)％(P＜0.05);10-7 mol/L钙泊三醇与TNF-α共同处理细胞后,S100A8表达较单独使用TNF-α时上调(1.873 ±0.153)倍(P＜0.01).结论 TNF-α可以诱导体外培养的角质形成细胞高度表达S100A8.钙泊三醇双向调节角质形成细胞S100A8表达:高浓度(10-5 mol/L)钙泊三醇下调S100A8表达,低浓度(10-7～10-8mol/L)钙泊三醇上调S100A8表达.
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紫外线对人角朊细胞的氧化损伤及防护研究
目的探讨紫外线A(UVA)对原代培养人皮肤角朊细胞的氧化损伤及防晒化妆品的防护效果.方法利用原代培养人皮肤角朊细胞,采用不同剂量的UVA照射,测定细胞上清液丙二醛,细胞内过氧化氢酶和超氧化物歧化酶,并对防晒化妆品的防护作用进行评价.结果 UVA照射剂量从2.88 J/cm2到11.52 J/cm2,MDA含量由2.54μmol/L增加到6.75 μmol/L,CAT含量由15.76 U/mg(prot)减少至6.33 U/mg(prot),SOD含量由25.55 NU/mg(prot)降至23.81 NU/mg(prot).涂抹广谱防晒化妆品后照射同样剂量的UVA,MDA由2.18μmol/L增至4.82μmol/L,CAT由17.19 U/mg(prot)减少至10.35 U/mg(prot),SOD由26.52 NU/mg(prot)降至24.51 NU/mg(prot).结论 UVA对人皮肤角朊细胞具有明显的氧化损伤作用,本实验条件下的广谱防晒化妆品对细胞具有一定的防护功能.
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长波紫外线对大鼠皮肤角朊细胞的损伤及茶多酚的保护作用
目的探讨长波紫外线(uVA)对原代培养的大鼠皮肤角朊细胞脂质过氧化和生长状况等影响，同时探讨一种植物多酚—茶多酚(TPP)在此过程中所起的作用。方法在原代培养大鼠皮肤角朊细胞基础上，经UVA照射后，测定角朊细胞胞浆酶—乳酸脱氢酶(LDH)释放情况，脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平，并测定培养细胞的存活率和细胞周期动力学。结果UVA可以引起体外培养的角朊细胞膜通透性增强，胞浆酶LDH释放增加(从827．55 U／L增至1 312．47 U／L)；脂质过氧化产物MDA水平升高，抗氧化酶GSH-Px水平降低；细胞存活率下降，细胞周期动力学表现为细胞增殖抑制：增殖指数(PI)从34．24％降至17．98％。天然提取物TPP(质量浓度为0．1％)可以比较明显地抑制UVA引起的上述损害。结论UVA可损伤原代培养的大鼠皮肤角朊细胞，TPP为天然防晒产品的开发提供理论依据。
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β-溶血型链球菌胃蛋白酶消化产物对银屑病 PBMCs和角质形成细胞的作用
目的:探讨链球菌M蛋白在银屑病发病中的可能机制.方法:应用胃蛋白酶消化的方法获得M蛋白粗品(pep-M),其不同剂量对银屑病组和健康人组外周血单一核细胞(PBMCs)增殖的影响用MTT方法检测.用3H-TdR掺入法和流式细胞仪检测pep-M对人角质形成细胞株Colo-16的作用.结果:pep-M可以明显促进银屑病组和对照组的PBMCs增殖(P＜0.05);并且银屑病组PBMCs的增殖强度要明显高于健康对照组(P＜0.05).pep-M不能明显促进体外培养的角质形成细胞DNA合成;相反,大剂量时出现Colo-16细胞死亡增多的现象,Colo-16细胞亚二倍体细胞的含量并未明显增加.结论:pep-M对角质形成细胞没有直接的促增殖作用.它可能通过M蛋白特异性的T淋巴细胞在银屑病发病中发挥作用.
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链球菌M蛋白同源角蛋白多肽在银屑病发病中的作用
目的 探讨与M蛋白同源的角蛋白肽段在银屑病发病中的作用.方法 人工合成与M蛋白同源的角蛋白肽段,氨基酸残基序列分别为ALEEAN、LKKDVDC、GLRRVLDE、RLKYENELA.4组合成同源肽段与银屑病患者和健康人(健康组)外周血单核细胞(PBMCs)共同培养.双抗体夹心ELISA法检测细胞因子白细胞介素(IL)-2、IL-4和γ干扰素(IFN-γ)的产生情况,MTT法检测PBMCs增殖情况.将合成同源肽段与角质形成细胞(HaCat)共培养,MTT法检测HaCat增殖情况,并对结果进行分析.结果 合成同源肽段ALEEAN和LKKDVDC均能刺激斑块型银屑病患者PBMCs增殖,IL-2、IL-4、IFN-γ分泌水平均显著高于健康组.在同源肽段GLRRVLDE、RLKYENELA中未检测到3种因子的表达.合成同源肽段ALEEAN、LKKDVDC、GLRRVLDE与角质形成细胞生长因子(KGF)共培养能促进HaCat增殖(均P＜0.05).结论 与M蛋白同源的某些角蛋白多肽可引起银屑病患者PBMCs和HaCat增殖,可能在银屑病,尤其是在β-溶血型链球菌感染后的银屑病皮损的维持与加重中起一定作用.
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不同类型子宫内膜异位症KGF及survivin的表达
目的:比较子宫腺肌症(AM)、卵巢子宫内膜异位症(OEMs)、角质细胞生长因子(KGF)、survivin蛋白表达的异同.方法:用免疫组化二步法分别检测40例正常子宫内膜、40例AM及34例OEMs患者的在位和异位内膜KGF、survivin的蛋白表达.结果:(1)本次入选对象KGF蛋白、survivin蛋白分别主要表达于子宫内膜间质细胞和腺体.(2)KGF表达在增殖期AM、OEMs在位内膜腺体均高于正常组,AM在位内膜高于异位内膜.分泌期AM、OEMs在位内膜腺体均高于异位内膜.增殖期AM在位及异位内膜间质、OEMs在位内膜间质中KGF.表达均高于正常组,AM异位内膜、OEMs在位内膜间质KGF表达均高于OEMs异位内膜.分泌期仅见OEMs在位内膜间质中KGF表达高于OEMs异位内膜.(3)survivin表达在增殖期AM、OEMs异位内膜腺体均高于正常,AM异位内膜腺体高于在位内膜.分泌期AM在位、异位内膜腺体均高于正常,OEMs在位高于异位,AM在位、异位腺体均分别高于OEMs.AM在位内膜间质高于正常,OEMs在位内膜间质高于异位内膜.结论:在位内膜不同于正常内膜,在位内膜特性可能决定了不同类型异位内膜的发生.异位内膜凋亡减少则可能是疾病进展的前提之一.AM与OEMs具有不同的生物化学特征及临床表现,对局部雌孕激素反应不同,但存在相同的发病基础.
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鞣花酸抑制黑素细胞黑素合成及黑素传递的实验研究
目的：观察鞣花酸对黑素细胞（melanocyte, MC）合成黑素以及传递黑素的影响并探讨其机制。方法分别纯化培养来自人包皮的表皮黑素细胞和角质形成细胞(keratinocyte, KC)，传第2代后以1∶10的比例将两细胞接种到3 cm×3 cm的小培养皿中，单独或混合培养的细胞经高、中、低（100、10、1 mg/L）3种浓度的鞣花酸干预48 h后，分别检测干预前后黑素细胞中黑素含量、酪氨酸酶活性的变化，采用流式法检测混合培养细胞中黑素传递的情况，以10 nmol/L熊果苷为阳性对照。结果3种浓度鞣花酸浓度均可下调细胞酪氨酸酶活性，并呈浓度依赖性。除了1 mg/L的鞣花酸对黑素细胞黑素合成无明显作用，其余浓度的鞣花酸均可降低黑素含量。鞣花酸同时具有抑制黑素传递的作用。结论鞣花酸可抑制黑素合成及黑素传递，或可作为一种皮肤美白剂应用。
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猪复合人工皮肤组织工程学研究:小型香猪角质形成细胞库的构建
目的:小型香猪与人的皮肤组织结构相似,是研究人皮肤良好的动物模型,构建贵州小型香猪角质形成细胞库,为构建猪组织工程皮肤做好准备工作.方法:采用分离酶和胰蛋白酶联合消化法分离小型香猪角质形成细胞,角质形成细胞培养基培养.结果:小型香猪角质形成细胞呈"铺路石"样生长,可连续传代,实验结束时成功地将角质形成细胞传至第13代.传代及冻存、复苏后的角质形成细胞保持了与原代细胞相同的生长状态,并具有继续传代能力.结论:作者通过细胞培养和组织工程学的方法,建立了小型香猪角质形成细胞库.
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体外人表皮细胞培养技术:不同滋养层细胞对角朊细胞生长融合的影响
目的:探索和寻找人角朊细胞体外培养适宜的滋养层细胞,完善人角朊细胞体外培养快速扩增的技术和方法.方法:实验于2003-08/2004-03在武装警察部队总医院烧伤整形科组织工程实验室完成.实验分别在3T3细胞、原代培养的人成纤维细胞上接种原代人角朊细胞,并设无滋养层细胞的空白对照.在对不同滋养层细胞的处理上分别采用了60Co放射线照射的传统方法和丝裂霉素处理,比较两种处理方法对滋养层细胞的影响,并对丝裂霉素适宜的作用浓度进行了研究.结果:①丝裂霉素和60Co放射线照射分别处理滋养层细胞,可取得相同效果.②终浓度为15 mg/L的丝裂霉素C是制备人成纤维细胞滋养层的较适宜浓度;终浓度为10 mg/L的丝裂霉素C是制备3T3细胞滋养层的较适宜浓度.③原代人角朊细胞在不同滋养层细胞上的生长速度显示:人成纤维细胞＞3T3细胞＞无滋养层细胞.结论:经丝裂霉素处理的原代培养人成纤维细胞作为滋养层细胞,体外扩增人角朊细胞可以缩短培养时间,减少接种密度.
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体外培养口腔黏膜角化细胞生物学的特性
目的一个稳定的人类正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系对于研究组织工程化口腔黏膜构建及口腔黏膜上皮癌变及阻断有重要意义.研究体外培养的人正常口腔黏膜角化细胞的细胞生物学特性.方法通过测定细胞生长曲线及克隆形成率了解细胞生长基本规律及其增殖能力 ,并通过流式细胞仪检测细胞染色体倍性.结果细胞接种后第 1～ 3天为静止生长期,第 5～ 10天处于对数生长期,第 12天后进入平台期.倍增时间为 24～ 48 h;接种密度为 200/cm2时,培养细胞克隆形成率为 0.979%.经流式细胞仪检测细胞染色体倍性结果表明原代及传代细胞均为二倍体细胞.结论体外连续培养的口腔黏膜角化细胞为正常上皮细胞,增殖能力良好.
